一种提高淀粉酶热稳定性的方法.pdf

1、10申请公布号CN104212788A43申请公布日20141217CN104212788A21申请号201410465826522申请日20140912C12N9/96200601C12N9/44200601C12N9/26200601C12N9/34200601C12N9/2420060171申请人江南大学地址214122江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号72发明人顾正彪李才明李兆丰班宵逢程力洪雁74专利代理机构北京爱普纳杰专利代理事务所特殊普通合伙11419代理人张勇54发明名称一种提高淀粉酶热稳定性的方法57摘要本发明公开了一种提高淀粉酶热稳定性的方法，属于酶工程技术领域。本发明通过

2、甘油与钾离子的协同添加显著提高淀粉酶的热稳定性，大大提高了酶的工业化应用价值，同时该发明操作简单、成本低廉，具有较好的推广潜力。51INTCL权利要求书1页说明书3页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页附图2页10申请公布号CN104212788ACN104212788A1/1页21一种酶热稳定性提高的酶液，其特征在于，由酶和稳定剂组成，稳定剂活性成分为甘油和钾离子。2根据权利要求1所述的酶液，其特征在于，所述酶为淀粉酶。3根据权利要求1所述的酶液，其特征在于，甘油与酶液的比例为5G至20G每100ML，钾离子浓度为01MM1MM。4根据权利要求1所

3、述的酶液，其特征在于，所述酶液中酶终浓度为520M。5根据权利要求2所述的酶液，其特征在于，所述淀粉酶是淀粉分支酶、中温淀粉酶、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、麦芽四糖生成酶或麦芽六糖生成酶中的任一一种。6根据权利要求14所述的任一酶液，其特征在于，所述酶液中钾离子是以下化合物溶解后的钾离子KCL、KNO3、K2SO4、KH2PO4、K2HPO4、K3PO4。7一种提高淀粉酶热稳定性的方法，其特征在于，是将甘油和钾离子用于提高酶的热稳定性。8根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述方法是将淀粉酶加入以甘油和钾离子为活性成分的体系中，混合后的酶液中甘油与酶液的比例为5G至20G每100ML，钾离子浓度为0

4、1MM1MM。9根据权利要求7方法，其特征在于，将酶液加入以甘油和钾离子为活性成分的体系中，混合后的酶液中酶终浓度为520M，甘油与酶液的比例为5G至20G每100ML，钾离子浓度为01MM1MM；所述酶为淀粉分支酶、中温淀粉酶、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、麦芽四糖生成酶或麦芽六糖生成酶中任一一种。10根据权利要求7方法，其特征在于，将淀粉分支酶加入以甘油和钾离子为活性成分的体系中，混合后的酶液中甘油与酶液的比例为5G至20G每100ML，钾离子浓度为01MM1MM。权利要求书CN104212788A1/3页3一种提高淀粉酶热稳定性的方法技术领域0001本发明涉及一种提高淀粉酶热稳定性的方法，属于酶

5、工程技术领域。背景技术0002在酶法合成过程中，酶的热稳定性是很关键的一个因素。酶的热稳定性高不仅可以延长酶的储存时间、减少酶在运输过程中酶活的损失，而且可以使酶在较高反应温度下延长酶的反应时间，提高生产效率，进而有效的降低生产成本。0003淀粉酶指作用于淀粉或其衍生物的一类酶，可催化水解或转苷反应。淀粉酶在食品、医药、纺织等工业中具有十分广泛的应用，提高淀粉酶的热稳定性对于其工业化应用具有重要意义。发明内容0004本发明提供了一种提高酶热稳定性的酶液，由酶和稳定剂组成，所述稳定剂活性成分为甘油和钾离子。0005所述酶液中甘油含量为520W/V，钾离子浓度为01MM1MM。0006所述甘油含量

6、为520W/V，是指每100ML酶液中含有甘油5G至20G。0007所述酶液中酶的终浓度为520M。0008所述酶液，在本发明的一种实施方式中以水为溶剂。0009所述钾离子是除KOH外的能形成钾离子的化合物，如KCL、KNO3、K2SO4、KH2PO4、K2HPO4、K3PO4等。0010所述酶液中的酶为淀粉酶0011所述淀粉酶是淀粉分支酶、中温淀粉酶、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、麦芽四糖生成酶或麦芽六糖生成酶中的任一一种。0012所述淀粉酶优选淀粉分支酶。0013本发明还提供一种提高酶的热稳定性的方法，是将甘油和钾离子用于提高酶的热稳定性。0014所述提高酶的热稳定性的方法，是在酶液中加入以甘油和

7、钾离子为活性成分的稳定剂，混合后的酶液中甘油终浓度为520W/V，钾离子终浓度为01MM1MM。0015所述提高酶的热稳定性的方法，混合后的酶液中酶终浓度为520M。0016所述提高酶的热稳定性的方法，是将淀粉酶加入以甘油和钾离子为活性成分的体系中，混合后的酶液中甘油含量与酶液的质量体积比为520，钾离子浓度为01MM1MM。0017经试验确定，本发明对淀粉分支酶、中温淀粉酶、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、麦芽四糖生成酶、麦芽六糖生成酶等均有一定效果。0018本发明方案能够提高淀粉酶热稳定性的原因可能是甘油的添加能够排斥酶分子周围的渗透质，使酶优先水化，提高其构象的稳定性；钾离子的添加能够增强这种水化

8、作说明书CN104212788A2/3页4用，同时有些酶上可能存在钾离子结合位点，能够进一步增强酶构象的稳定。本发明通过甘油与钾离子的协同添加显著提高淀粉酶的热稳定性，大大提高了酶的工业化应用价值，同时该发明操作简单、成本低廉，具有较好的推广潜力。附图说明0019图1不同浓度甘油对淀粉分支酶热稳定性的影响，其中，未添加甘油；20甘油；10甘油；75甘油；5甘油0020图2不同浓度钾离子对淀粉分支酶热稳定性的影响，其中，未添加钾离子；01MM钾离子；05MM钾离子；1MM钾离子0021图3甘油和钾离子对淀粉分支酶热稳定的影响，其中，未添加助剂；10甘油；10甘油和05MM钾离子具体实施方式002

9、2实施例10023淀粉分支酶的热稳定性分析方法淀粉分支酶在一定温度下保温，不同时间点取样，迅速冷却至0，测定酶的残余活力，以未保温酶液的活力为100。绘制相对酶活与时间的曲线。0024淀粉分支酶活力的测定方法取适当稀释的酶液300L，加入装有预先用50MM的MOPS缓冲液PH70配制的100MG/ML直链淀粉溶液中，在50下反应120MIN。反应结束后沸水浴中灭酶15MIN。将反应液在室温下保温20MIN后，离心取上清液1ML，加入1ML醋酸钠缓冲液PH35和100L异淀粉酶1000U，SIGMA，I5284，在37下200R/MIN的摇床中反应20H。反应结束后在沸水浴中灭酶15MIN，利用

10、二硝基水杨酸法测定体系中还原糖量。一个酶活单位定义为单位时间内产生1MMOL的1,6糖苷键所需要加入淀粉分支酶的量。0025实施例20026将来源于GEOBACILLUSTHERMOGLUCOSIDANSSTB02的淀粉分支酶与甘油混合均匀制得酶溶液，其中甘油终浓度分别为5、75、10、20W/V，酶浓度为5M，将该酶溶液于4静置60MIN，在65下测定淀粉分支酶的热稳定性，结果如图1所示，该淀粉分支酶65下的半衰期约为50MIN，与空白对照相比，添加甘油后淀粉分支酶的热稳定性显著提高，终浓度为520W/V的甘油均能将该淀粉分支酶65下的半衰期提高至120MIN以上。0027实施例30028在

11、淀粉分支酶溶液中，加入KCL使钾离子终浓度分别为01MM、05MM、1MM，酶的终浓度为20M，混匀，4静置60MIN，65下测定淀粉分支酶的热稳定性，结果如图2所示，与空白对照相比，淀粉分支酶的热稳定性变化不大。0029实施例40030将甘油水溶液与来源于GEOBACILLUSTHERMOGLUCOSIDANSSTB02的淀粉分支酶混合，使甘油终浓度为10W/V，酶浓度为10M，并添加KCL溶液，钾离子终浓度为05MM，混匀，4静置60MIN，在65下测定淀粉分支酶的热稳定性，结果如图3所示，与不添加助说明书CN104212788A3/3页5剂的空白对照或者只添加10甘油的对照相比，淀粉分支

12、酶的热稳定性显著提高。在65下保温2H，其相对活力为空白的46倍；与单独添加甘油相比，是其在65下保温2H后残余活力的13倍。0031实施例50032将甘油水溶液与来源于GEOBACILLUSTHERMOGLUCOSIDANSSTB02的淀粉分支酶混合，使甘油终浓度为20W/V，并添加K2SO4溶液，钾离子终浓度为1MM，混匀，4静置60MIN，分别在45、50、55下测定淀粉分支酶的热稳定性，与不添加助剂的空白对照或者只添加20甘油的对照相比，淀粉分支酶的热稳定性显著提高。在45、50、55下分别保温4H，其相对活力为空白的58倍；与单独添加甘油相比，是其在对应温度下保温4H后残余活力的11

13、25倍。0033实施例60034在来源于GEOBACILLUSTHERMOGLUCOSIDANSSTB02的淀粉分支酶酶液中，加入以甘油和钾离子为活性成分的稳定剂，使甘油终浓度为5W/V，酶浓度为5M，钾离子终浓度为01MM，混匀，4静置60MIN，在55下测定淀粉分支酶的热稳定性，与不添加助剂的空白对照或者只添加5甘油的对照相比，淀粉分支酶的热稳定性显著提高。在55下分别保温4H，其相对活力为空白的46倍；与单独添加甘油相比，是其在对应温度下保温4H后残余活力的156倍。0035实施例70036麦芽六糖生成酶的热稳定性分析方法酶液在一定温度下保温，不同时间点取样，迅速冷却至0，测定酶的残余活

14、力，以未保温酶液的活力为100。绘制相对酶活与时间的曲线。0037麦芽六糖生成酶活力的测定方法采用DNS法。取适当稀释的酶液02ML，加入装有18ML预先用20MM柠檬酸/磷酸氢二钠缓冲液PH65配置的1W/V可溶性淀粉溶液的10ML比色管中，在45下反应15MIN后，加入20MLDNS停止反应，在沸水浴中准确加热5MIN，冷水冷却至室温，加入40ML蒸馏水，震荡均匀，在540NM下测定吸光值，用蒸馏水调零点。以失活的酶作为空白。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1G还原糖所需的酶量。0038实施例80039将甘油水溶液与来源于BACILLUSSTEAROTHERMOPHILUS的麦芽六

15、糖生成酶混合，使甘油终浓度为20W/V，酶浓度为10M，并添加KNO3溶液，钾离子终浓度为01MM1MM，混匀，4静置60MIN，在60下测定麦芽六糖生成酶的热稳定性，与不添加助剂的空白对照或者只添加20甘油的对照相比，麦芽六糖生成酶的热稳定性显著提高。在60下保温1H，其相对活力为空白的123倍；与单独添加甘油相比，是其在60下保温1H后残余活力的112倍。0040虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。说明书CN104212788A1/2页6图1图2说明书附图CN104212788A2/2页7图3说明书附图CN104212788A