一种用灵发素诱导甘蔗愈伤组织的方法.pdf

1、(10)授权公告号 CN 101861834 B (45)授权公告日 2011.10.26 CN 101861834 B *CN101861834B* (21)申请号 201010216180.9 (22)申请日 2010.07.02 A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人 广西壮族自治区甘蔗研究所 地址 530007 广西壮族自治区南宁市大学东 路 172 号 (72)发明人 蓝桃菊 许鸿源 方锋学 李松 余坤兴 刘红坚 刘晓燕 谭芳 龚银花 刘丽敏 淡明 杨荣仲 游建华 唐红琴 卢曼曼 (74)专利代理机构 广西南宁公平专利事务所有 限责任公司 45104 代理人 黄永校

2、(54) 发明名称 一种用灵发素诱导甘蔗愈伤组织的方法 (57) 摘要 一种用灵发素诱导甘蔗愈伤组织的方法。以 MS 为基本培养基， 添加灵发素 0.05-0.5mgL-1配 制成改良型固体培养基， 以甘蔗幼叶切片作外植 体， 按常规进行无菌培养。 该方法用于甘蔗愈伤组 织的诱导， 诱导效率高达 90 -95， 而且愈伤组 织不易褐化， 质地疏松不板结， 增殖快， 生命力强。 (51)Int.Cl. 审查员 王颖 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 2 页 CN 101861834 B1/1 页 2 1. 一种用灵发素诱导甘蔗愈伤组织的方法， 其

3、特征是， 以甘蔗末梢部位的幼叶切片为 外植体， 以 MS 固体培养基为基本培养基， 添加灵发素 0.05-0.50mgL-1， 制成改良型 MS 固 体培养基， 在常规培养条件下用于甘蔗愈伤组织的诱导。 2. 根据权利要求 1 所述用灵发素诱导甘蔗愈伤组织的方法， 其特征是， 所述诱导是在 pH 5.8-6.0 ； 光照1500-2000lx， 10-12小时/天 ； 温度 ： 昼/夜为28/25(1)的条件下进 行。 权 利 要 求 书 CN 101861834 B1/2 页 3 一种用灵发素诱导甘蔗愈伤组织的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种用灵发素诱导甘蔗愈伤组织的方法。 技术背景

4、 0002 甘蔗愈伤组织的获得， 被认为是甘蔗良种快速繁殖、 脱毒复壮、 转基因育种、 辐照 诱变育种等各种现代生物技术体系得以在甘蔗种植业成功建立的必要环节。 而现有可查资 料表明， 目前用于诱导甘蔗 ( 外植体多为蔗梢幼叶 ) 愈伤组织发生的植物生长物质 (Plant growth substances)几乎无一例外都属于生长素类(Auxin)， 包括2， 4-D(2， 4-二氯苯氧乙 酸 )， NAA( 萘乙酸 ) 和 IBA( 吲哚丁酸 ) 等， 其中以 2， 4-D 的应用得最为普遍， 效果也被认为 最好。但是， 2， 4-D 是人工化学合成的苯类衍生物， 具有毒性和残留， 其诱导甘

5、蔗愈伤组织 的使用浓度高达 2.0-3.0mgL-1， 在低浓度下诱导率往往不足 50。再者， 2， 4-D 诱导出的 愈伤组织很容易褐化和板结， 直接影响愈伤组织的继续增殖与分化， 严重的褐化甚至导致 外植体的死亡。 为此， 技术人员不得不频繁地把外植体转接到新鲜的培养基上， 既麻烦又费 工。灵发素 (Lingfasu， LFS， 代号 PGR-08) 是一种新型的生物源植物生长物质， 属于腺嘌呤 衍生物， 无毒害和残留。它既具有细胞分裂素 (CTK) 的基本化学结构和生物活性， 又同时具 有生长素 (Auxin) 的生物活性。LFS 已在被公认为难以组培的中药材 - 三七的愈伤组织 诱导中

6、获得成功 ( 许鸿源， 等。中药材， 2004， 27(1) ： 1-3)。LFS 在甘蔗愈伤组织诱导中的 最佳使用浓度不到 2， 4-D 的十分之一， 但其诱导率却可高达 90以上， 获得的愈伤组织不 易褐化， 或只轻度褐化， 不易板结， 增殖快， 生命力强。所以， 将来在甘蔗生物技术研究和应 用中极有可能成为 2， 4-D 的替代品。 发明内容 0003 本发明要解决的技术问题是提供一种用灵发素诱导甘蔗愈伤组织的方法。 0004 本发明以如下技术方案解决上述技术问题 ： 一种用灵发素诱导甘蔗愈伤组织的方 法， 包括如下步骤 ： 0005 以甘蔗末梢部位的幼叶切片为外植体， 以 MS 固体培

7、养基为基本培养基， 添加灵发 素 0.05-0.50mgL-1， 制成改良型 MS 固体培养基， 在常规培养条件下用于甘蔗愈伤组织的 诱导。 0006 本发明的突出优点在于 ： 0007 本发明用于甘蔗愈伤组织的诱导， 诱导效率高达 90 -95， 而且愈伤组织不易 褐化， 质地疏松不板结， 增殖快， 生命力强。 具体实施方式 0008 以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。 0009 本发明所述用灵发素诱导甘蔗愈伤组织的方法， 包括如下步骤 ： 0010 按常规采集甘蔗末梢部位的幼叶作外植体， 表面消毒杀菌后切成大约 1， 说 明 书 CN 101861834 B2/2 页 4 00

8、.5cm2的小片分别接入添加有灵发素 0.05-0.50mgL-1的改良型 MS 固体培养基中， 用 于甘蔗愈伤组织的诱导。 培养条件 ： pH 5.8-6.0 ； 光照1500-2000lx.10-12小时/天 ； 温度 ： 昼 / 夜 28/25(1)。 0011 表 1 中例 1 为对比例， 例 2 至例 5 为添加不同量的灵发素实施例， 其余操作条件和 方法步骤相同。 0012 表 1. 添加不同量的灵发素与 2， 4-D 诱导甘蔗愈伤组织的对比实验数据 0013 0014 表 1 中 LFS 为灵发素。 0015 表 1 内数据为培养 20 天的数据， 20 天内不转换新鲜培养基。

9、0016 注 ： 出愈率 ( ) ： 出愈幼叶切片数 / 接种幼叶切片数 100。 0017 褐化率 ( ) ： 褐化幼叶切片数 ( 无论出愈与否 )/ 接种幼叶切片数 100。 0018 褐化程度 ( ) ： 以 “+” 多少表示。 0019 板结率 ( ) ： 愈伤组织紧实、 难增殖分化的幼叶切片数 / 出愈幼叶切片 数 100。 0020 转绿率 ( ) ： 部分愈伤组织呈现绿色的幼叶切片数 / 出愈幼叶切片数 10 0021 从表 1 的五个实施例对比实验数据可以看出， 采用本发明诱导甘蔗愈伤组织的出 愈率与愈伤组织质量优于对照例。 0022 上述五个实施实例对本发明的技术方案做了较为详细地描述， 但是在本发明的基 础上， 本领域的技术人员对基本培养基 MS 进行替换或对添加物及其用量进行补充与修改， 是显而易见的事。 因此， 凡在诱导甘蔗愈伤组织的培养程序中添加有灵发素的， 均属于本发 明要求保护的范围。 说 明 书