一种防治弧菌病中药组合物及其制备方法和应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710203170.3 (22)申请日 2017.03.30 (71)申请人 广州市普精生物科技有限公司 地址 510000 广东省广州市高新技术产业 开发区科学城揽月路3号广州国际企 业孵化器F区410房 (72)发明人 朱盛山 (74)专利代理机构 北京市盈科律师事务所 11344 代理人 刘雪花 (51)Int.Cl. A61K 36/85(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (54)发明名称 一种防治弧菌病中药组合物及其制备方法 和应用 (57

2、)摘要 本发明涉及一种防治弧菌病组合物及其制 备方法和应用。 所述组合物有效成分包含下述重 量份的下述组分： 半边莲花200300重量份、 檵 木叶400500重量份、 X 200500重量份， 其中X 为黄芪、 牡荆花、 地胆草花、 黄连叶、 黄芩中的一 种或多种。 本发明组合物采用檵木叶、 半边莲花 等中草药作为有效成分， 对弧菌病的防治效果 好， 且毒副作用小， 无残留， 病原体不易产生耐药 性。 本发明组合物的原料来源广泛， 成本低， 可以 制成多种剂型， 应用更灵活。 本发明所述防治弧 菌病组合物具有抗弧菌病、 抗原虫、 增强机体免 疫力的作用， 可用于制备防治弧菌病的药物， 具 有

3、推广应用价值。 权利要求书1页 说明书14页 附图2页 CN 106924449 A 2017.07.07 CN 106924449 A 1.一种防治弧菌病中药组合物， 其特征在于， 其有效成分包含下述重量份的下述组分： 半边莲花200300重量份、 檵木叶400500重量份、 X 200500重量份， 其中X为黄芪、 牡荆 花、 地胆草花、 黄连叶、 黄芩中的一种或多种。 2.根据权利要求1所述的组合物， 其特征在于， 所述组合物还包含辅料100700重量 份， 辅料为鱼粉、 粗蛋白、 豆粕、 面粉、 糊精、 葡萄糖、 矿物质中的一种或多种。 3.根据权利要求2所述的组合物， 其特征在于，

4、所述组合物包含下述重量份的下述组 分： 半边莲花230270重量份、 檵木叶440460重量份、 X 200400重量份、 辅料250500 重量份。 4.一种防治弧菌病中药组合物的制备方法， 其特征在于， 包括如下步骤： S1、 以818倍药材原料重量的水提取檵木叶、 半边莲花混合物1-3次， 每次12小时， 滤过； 合并滤液， 5080减压浓缩成第一稠膏， 快速搅拌下向第一稠膏内加入乙醇， 使乙 醇的体积含量为6080， 静置过夜， 取上清液滤过， 滤液回收乙醇， 5080减压浓缩成 第二稠膏； S2、 以810倍量8595乙醇、 6080乙醇提取X 2次， 每次12小时， 滤过； 合并滤

5、 液， 5080减压回收乙醇、 浓缩成第三稠膏； 合并第二稠膏和第三稠膏得到稠膏混合物； S3、 将稠膏混合物与辅料配制成防治弧菌病中药组合物。 5.根据权利要求4所述的制备方法， 其特征在于， 步骤S3中稠膏混合物与辅料采用如下 之一方法配制成防治弧菌病中药组合物： 方法A： 取水加热至8090， 加入葡萄糖、 矿物质， 快速搅拌至完全溶解， 加入稠膏混 合物， 4560保温搅匀， 得到防治弧菌病中药组合物液体剂； 方法B： 取鱼粉、 粗蛋白、 豆粕、 面粉混匀， 加入稠膏混合物， 搅匀制粒烘干得到防治弧菌 病中药组合物颗粒剂； 方法C： 取水加热至8090， 加入糊精、 葡萄糖、 矿物质，

6、 快速搅拌至完全溶解， 加入稠 膏混合物， 4560保温搅匀， 得到防治弧菌病中药组合物膏剂。 6.根据权利要求5所述的制备方法， 其特征在于， 方法A和方法C中水的用量为稠膏混合 物重量的1530， 方法A和方法C中在50保温搅匀。 7.根据权利要求5所述的制备方法， 其特征在于， 方法A、 方法B和方法C中添加防腐剂搅 拌均匀。 8.根据权利要求4所述的制备方法， 其特征在于， 稠膏混合物与总药材原料的重量比为 0.81.5:5。 9.权利要求1-3任一项所述的组合物在制备用于防治弧菌病的药物中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 所述弧菌病为对虾的弧菌病。 权 利 要 求 书 1/

7、1 页 2 CN 106924449 A 2 一种防治弧菌病中药组合物及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及中药组合物领域， 具体涉及一种防治弧菌病组合物及其制备方法和应 用。 背景技术 0002 弧菌病是对虾养殖过程中最常见的问题之一， 不论在过去还是现在， 国内或国外 都认为其是阻碍对虾养殖事业发展的重要原因之一， 目前尚缺乏较理想的药物。 0003 我国对虾养殖业曾创造过辉煌的业绩， 成为经济效益最好的产业之一， 为繁荣沿 海经济、 丰富国内外市场做出了重要贡献。 据联合国粮农组织(FAO)估计， 外海渔虾业的过 度开发导致捕捞量下降， 到2020年全球的海产食品中将有一半来

8、自于水产养殖业。 2007年 中国对虾养殖产量达到126万吨， 约占世界养殖总产量的37， 出口额达到11.4亿美元， 近 百万农渔民通过从事对虾养殖生产摆脱了贫困， 走上了致富道路。 随着对虾集约化养殖产 业的形成与发展和对虾种苗与商品虾的进出口， 对弧菌病的爆发越来越频繁， 传播速度也 越来越快， 近年虾的养成率不到20。 2007年7月， 广东部分地区南美白对虾红体病的发病 率达到95， 病虾的死亡率达到100。 2013年45月份， 广东江门睦州市场2个区域中的棚 尾虾出现7080排塘率， 以2040天的虾为主。 不少养殖业者， 经济损失严重， 甚至不少 养殖场破产倒闭， 给整个养殖业

9、的健康发展造成严重的威胁， 已引起全社会关注。 调查发现 对虾养殖失败原因中， 弧菌感染性疾病占85以上。 0004 农业部提倡研究中草药在水产行业的作用， 发掘能对抗水产病害的中草药。 市面 水产类抗菌中成药， 抑菌效果并不理想， 原因主要是组方随意， 加工粗， 给药方式泼洒不合 理， 夸大产品功效。 因此， 为了使水产养殖业健康、 可持续地发展， 研究开发出一种毒副作用 小、 无残留、 病原体不易产生耐药性的中草药成为当前抗对虾弧菌感染性疾病药物研究很 有必要。 发明内容 0005 有鉴于此， 有必要针对上述的问题， 提供一种防治弧菌病中药组合物及其制备方 法和应用。 0006 本发明上述

10、目的通过以下技术予以实现： 0007 一种防治弧菌病中药组合物， 其有效成分包含下述重量份的下述组分： 半边莲花 200300重量份、 檵木叶400500重量份、 X 200500重量份， 其中X为黄芪、 牡荆花、 地胆 草花、 黄连叶、 黄芩中的一种或多种。 0008 优选地， 所述组合物还包含辅料100700重量份， 辅料为鱼粉、 粗蛋白、 豆粕、 面 粉、 糊精、 葡萄糖、 矿物质中的一种或多种。 0009 优选地， 所述组合物包含下述重量份的下述组分： 半边莲花230270重量份、 檵木 叶440460重量份、 X 200400重量份、 辅料250500重量份。 0010 本发明所述防

11、治弧菌病中药组合物的制备方法， 包括如下步骤： 说 明 书 1/14 页 3 CN 106924449 A 3 0011 S1、 以818倍药材原料重量的水提取檵木叶、 半边莲花混合物1-3次， 每次12小 时， 滤过； 合并滤液， 5080减压浓缩成第一稠膏， 快速搅拌下向第一稠膏内加入乙醇， 使 乙醇的体积含量为6080， 静置过夜， 取上清液滤过， 滤液回收乙醇， 5080减压浓缩 成第二稠膏； 0012 S2、 以810倍量8595乙醇、 6080乙醇提取X 2次， 每次12小时， 滤过； 合 并滤液， 5080减压回收乙醇、 浓缩成第三稠膏； 合并第二稠膏和第三稠膏得到稠膏混合 物；

12、 0013 S3、 将稠膏混合物与辅料配制成防治弧菌病中药组合物。 0014 优选地， 步骤S3中稠膏混合物与辅料采用如下之一方法配制成防治弧菌病中药组 合物： 0015 方法A： 取水加热至8090， 加入葡萄糖、 矿物质， 快速搅拌至完全溶解， 加入稠 膏混合物， 4560保温搅匀， 得到防治弧菌病中药组合物液体剂； 0016 方法B： 取鱼粉、 粗蛋白、 豆粕、 面粉混匀， 加入稠膏混合物， 搅匀制粒烘干得到防治 弧菌病中药组合物颗粒剂； 0017 方法C： 取水加热至8090， 加入糊精、 葡萄糖、 矿物质， 快速搅拌至完全溶解， 加 入稠膏混合物， 4560保温搅匀， 得到防治弧菌病

13、中药组合物膏剂。 0018 优选地， 方法A和方法C中水的用量为稠膏混合物重量的1530。 0019 优选地， 方法A和方法C中在50保温搅匀。 0020 优选地， 方法A、 方法B和方法C中添加防腐剂搅拌均匀。 防腐剂用量优选为组合物 重量的0.010.05， 防腐剂可以抑制微生物生长， 防止组合物腐败变质， 延长组合物的保 质期。 0021 优选地， 稠膏混合物与总药材原料的重量比为0.81.5:5。 0022 优选地， 稠膏混合物与总药材原料的重量比为1:5。 0023 优选地， 第一稠膏与药材原料的重量比为0.81.2:1， 第二稠膏与其药材原料的 重量比为0.51.5:3， 第三稠膏

14、与其药材原料的重量比为0.51.5:4。 0024 上述组合物在制备用于防治弧菌病的药物中的应用。 0025 所述弧菌病为水产动物的弧菌病， 优选为对虾的弧菌病。 0026 本发明处方配伍既有中医的清热解毒、 驱虫之功， 又有现代医学的抗菌抗病毒、 杀 虫、 调节免疫功能之效， 又有现代医学的抗菌抗病毒、 杀虫、 调节免疫功能之效， 是防治弧菌 病的良方。 其中檵木叶味苦、 涩， 性寒， 解毒， 收敛， 止血； 半边莲花清热解毒， 利尿散结， 具有 抗菌、 抗肿瘤和利胆作用； 黄芪味甘， 性微温， 能增强机体免疫功能， 具有保肝、 利尿、 抗衰 老、 抗应激、 降压和较广泛的抗菌作用； 杜荆花

15、味苦、 性寒， 解表化湿， 祛痰平喘， 杀毒， 抗菌， 止痛， 能增强机体免疫功能； 黄连味苦、 性寒， 清热泻火， 燥湿解毒， 具有抗菌、 抗病毒和抗原 虫的作用； 地胆草花味苦辛、 性寒， 清热解毒， 凉血消肿。 现代化学和药理学研究表明： 半边 莲具有较强的杀菌、 抑菌活性； 檵木叶具有广谱抗菌作用， 叶的提取物在试管内对链球菌、 葡萄球菌、 伤寒及大肠杆菌等均有抑制作用， 煎剂可作皮肤消毒剂； 地胆草花具有较强的抗 菌、 抗细胞毒和肿瘤作用； 佐以黄芪增强机体免疫功能、 抗应激、 保肝， 牡荆花抗菌、 驱虫。 0027 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果： 本发明组合物采用檵木叶

16、、 半边莲花 等中草药作为有效成分， 对弧菌病的防治效果好， 且毒副作用小， 无残留， 病原体不易产生 说 明 书 2/14 页 4 CN 106924449 A 4 耐药性。 本发明组合物的原料来源广泛， 成本低， 可以制成多种剂型， 应用更灵活。 本发明所 述防治弧菌病组合物具有抗弧菌病、 抗原虫、 增强机体免疫力的作用， 可用于制备防治弧菌 病的药物， 具有推广应用价值。 附图说明 0028 图1为体外抑弧菌比较试验结果示意图。 0029 图2为各待测样品在96h内的溶菌酶变化趋势图。 0030 图3为各待测样品在96h内的谷草转氨酶变化趋势图。 0031 图4为各待测样品在96h内的酸

17、性磷酸酶变化趋势图。 具体实施方式 0032 为了更好的说明本发明， 下面结合具体实施方式做进一步说明。 本发明中所用试 剂或仪器均可由市场购得， 使用的检测方法等都是本领域所熟知的， 在此不再赘述。 本发明 中水提、 醇提等操作及条件， 除特别说明外， 采用现有技术。 0033 实施例1 0034 一种防治弧菌病中药组合物， 其是由檵木叶、 半边莲花、 黄芪、 葡萄糖、 矿物质按下 述重量份配比制备而成： 0035 0036 以下详细说明本发明组合物的制备方法： 0037 S1、 将檵木叶、 半边莲花混合， 以12倍药材原料重量的水提取2次， 每次1.5小时， 滤 过； 合并滤液， 65减压

18、浓缩成第一稠膏， 第一稠膏与药材原料的重量比为1:1； 快速搅拌下 向第一稠膏内加入乙醇使含醇量为70， 静置过夜， 取上清液滤过， 滤液在65减压回收乙 醇、 浓缩成第二稠膏， 第二稠膏与药材原料的重量比为1:3； 0038 S2、 将地黄连叶、 黄芪、 黄芩混合， 以10倍药材原料重量的90乙醇、 70乙醇各提 取1次， 每次1.5小时， 滤过； 合并滤液， 65减压回收乙醇、 浓缩成第三稠膏， 第三稠膏与药 材原料的重量比为1:4； 合并第二稠膏和第三稠膏得到稠膏混合物； 0039 S3、 溶解： 取稠膏混合物重量20的水加热至8090， 加入葡萄糖、 矿物质， 快速 搅拌至完全溶解，

19、加入稠膏混合物， 50保温搅匀， 加入防腐剂搅匀， 防腐剂用量为组合物 重量的0.05， 将混合药液放冷置灌装机中， 灌装， 封口， 即得防治弧菌病中药组合物液体 剂。 说 明 书 3/14 页 5 CN 106924449 A 5 0040 实施例2 0041 一种防治弧菌病中药组合物， 其是由半边莲花、 檵木叶、 牡荆花、 黄连叶、 鱼粉、 粗 蛋白、 豆粕、 面粉按下述重量份配比制备而成： 0042 0043 以下详细说明本发明组合物的制备方法： 0044 S1、 将檵木叶、 半边莲花混合， 以818倍药材原料重量的水提取2次， 每次1小时， 滤过； 合并滤液， 80减压浓缩成第一稠膏，

20、 第一稠膏与药材原料的重量比为1.2:1； 快速搅 拌下向第一稠膏内加入乙醇， 使乙醇体积含量为60， 静置过夜， 取上清液滤过， 滤液在80 减压回收乙醇、 浓缩成第二稠膏， 第二稠膏与药材原料的重量比为0.5:3； 0045 S2、 将牡荆花、 黄连叶混合， 以8倍量95乙醇、 75乙醇各提取1次， 每次2小时， 滤 过； 合并滤液， 5080减压回收乙醇、 浓缩成第三稠膏， 第三稠膏与药材原料的重量比为 1.5:4； 合并第二稠膏和第三稠膏得到稠膏混合物； 0046 S3、 取鱼粉、 粗蛋白、 豆粕、 面粉混匀， 加入稠膏混合物搅匀， 加入防腐剂， 防腐剂用 量为组合物重量的0.01，

21、搅匀， 制成颗粒， 70烘干， 分装， 封口， 即得防治弧菌病中药组 合物颗粒剂。 0047 实施例3 0048 一种防治弧菌病中药组合物， 其是由檵木叶、 半边莲花、 黄芪、 牡荆花、 糊精、 葡萄 糖、 矿物质按下述重量份配比制备而成： 0049 0050 以下详细说明本发明组合物的制备方法： 说 明 书 4/14 页 6 CN 106924449 A 6 0051 S1、 将檵木叶、 半边莲花混合， 以18倍药材原料重量的水提取2次， 每次1小时， 滤 过； 合并滤液， 5080减压浓缩成第一稠膏， 第一稠膏与药材原料的重量比为1.2:1； 快速 搅拌下向第一稠膏内加入乙醇， 使乙醇体积

22、含量为60， 静置过夜， 取上清液滤过， 滤液在 5080减压回收乙醇、 浓缩成第二稠膏， 第二稠膏与药材原料的重量比为1.5:3； 0052 S2、 将黄芪、 牡荆花混合， 以810倍量90乙醇、 70乙醇各提取1次， 每次1小时， 滤过； 合并滤液， 5080减压回收乙醇、 浓缩成第三稠膏， 第三稠膏与药材原料的重量比 为0.5:4； 合并第二稠膏和第三稠膏得到稠膏混合物； 0053 S3、 取水加热至8090， 加入糊精、 葡萄糖、 矿物质， 快速搅拌至完全溶解， 加入 稠膏混合物， 50保温搅匀， 加入防腐剂， 防腐剂用量为组合物重量的0.03， 搅匀， 放冷置 灌装机中， 灌装， 封

23、口， 即得防治弧菌病中药组合物膏剂。 0054 实例4、 体外抑弧菌比较试验 0055 取池塘水， 分为6组， 每组2L。 6组分别使用本发明防治弧菌病中药组合物、 中药三 黄散、 六黄液、 弧菌克星、 板蓝根末、 空白组(不用药)， 按标示量投药后， 再各取50 l均匀涂 布于TCBS弧菌培养皿上， 20h后观察结果如图1所示。 图1从左至右依次为本发明防治弧菌病 中药组合物组、 三黄散组、 六黄液组、 弧菌克星组、 板蓝根末组和空白组。 本发明防治弧菌病 中药组合物抑制弧菌效果明显， 无弧菌生长， 其他各组药物抑菌效果差， 有大量弧菌生长。 0056 实例5、 虾体弧菌试验研究 0057

24、取初期弧菌感染发病的对虾(仍能摄食)， 平均分到2个桶中作为实验组和对照组， 每桶25只。 对照组不用药， 正常喂料。 实验组采用本发明防治弧菌病中药组合物， 采用如下 方法喂料： 0058 第一天停止喂料。 上午， 取防治弧菌病中药组合物液体剂和颗粒剂按照重量比1:3 混合， 取混合后的防治弧菌病中药组合物0.3ml与饲料1g拌匀投喂； 傍晚， 取防治弧菌病中 药组合物液体剂和颗粒剂按照重量比1:3混合， 混合后的防治弧菌病中药组合物0.3ml与饲 料1g拌匀， 投喂。 第二天上午给饲料前， 取防治弧菌病中药组合物液体剂和颗粒剂按照重量 比1:3混合， 混合后的防治弧菌病中药组合物0.3ml

25、与饲料1g拌匀投喂， 后正常喂料； 傍晚给 饲料前， 取防治弧菌病中药组合物液体剂和颗粒剂按照重量比1:3混合， 混合后的防治弧菌 病中药组合物0.3ml与饲料1g拌匀投喂， 后正常喂料。 第三天起正常喂料。 0059 观察并记录各组对虾存活数、 吃料情况和肝、 胃、 肠情况。 吃料情况为喂料后半小 时观察的对虾吃料情况， 肝、 胃、 肠情况是观察对虾是否出现断肠、 空肠， 空胃， 肝萎缩、 红肿 等情况。 结果如表1所示。 0060 由表1可知， 对照组对虾存活数逐渐减少， 第4天仅剩余5只， 吃料情况先减少， 第2 天起不吃料， 出现空胃、 空肠、 肝脏萎等现象。 实验组对虾死亡率低， 第

26、4天存活数为12只， 吃 料情况先减少， 至第4天起恢复正常， 绝大部分胃肠饱满、 肝脏正常。 0061 表1、 对虾各指标情况 说 明 书 5/14 页 7 CN 106924449 A 7 0062 0063 实施例6、 提高酶活性实验 0064 选取大小比较均匀的健康对虾200尾， 平均质量为(6.221.37)g、 体长(7.16 0.52)cm， 随机分成2组， 分别为对照组和实验组， 每组100尾， 于100L圆柱形桶(直径50cm)中 进行养殖。 0065 对照组： 采用溶藻弧菌(1108Cfu/ML)腹腔注射0.1ml感染； 实验组： 进行弧菌感 染， 第一餐采用本发明防治弧菌

27、病中药组合物拌饲料(100g/Kg)后投喂， 余下均正常投喂饲 料； 以上各组每餐饲料投喂量均为对虾体重的20。 0066 实验周期为4天， 在实验过程中分别于2、 4、 8、 12、 24、 48、 96h依次处死各组别对虾 10尾， 分别用1mL注射器从头胸甲后部插入心区采血及割取部分肝组织、 低温匀浆， 注入无 菌离心管中， 于4、 6000r/min离心15min， 分离血清于-80冰箱保存， 用于相关免疫指标 的测定。 0067 对虾血清的谷草转氨酶(AST/GOT)、 酸性磷酸酶(ACP)、 溶菌酶(LZM)等免疫因子活 性的测定采用南京建成生物工程研究所的试剂盒， 具体方法依该试

28、剂盒说明操作。 0068 (1)溶菌酶(LZM)检测 0069 溶菌酶活性反映吞噬细胞的活化状态， 是对虾抗菌防御机能力的体现。 所测样品 在不同时间点测得的具体溶菌酶值见表2， 变化趋势见图2。 说 明 书 6/14 页 8 CN 106924449 A 8 0070 表2、 各待测样品在不同时间点测得的LZM值 0071 LZM(U/ml)实验组对照组 2h0.0611.640.0491.91 4h0.0883.07*0.0412.70 8h0.0912.1*0.0391.70 12h0.081.72*0.0281.93 24h0.0681.23*0.0221.66 48h0.0613.4

29、1*0.0192.10 96h0.0591.44*0.0192.32 0072 注： 数据表示为平均值标准差(n6)， *表示与对照组比较P0.05。 0073 由图2和表2可见， 在观察期内， 实验组的LZM在8h达到最佳水平， 与对照组差距达 0.043U/ml； 而后逐渐降低， 但均高于正常水平。 对照组的LZM活性在2h时为最佳， 而后逐渐 降低， 但均低于正常水平。 0074 (2)谷草转氨酶(AST/GOT)的检测 0075 谷草转氨酶酶活性的高低与肝细胞的解毒功能关系密切， 是反映肝细胞受损的指 标。 所测样品在不同时间点测得的具体谷草转氨酶值见表3， 变化趋势见图3。 0076

30、 分析表3和图3数据可知， 24h之后， 实验组与对照组受试动物体内的谷草转氨酶活 性出现显著差异(P0.05)； 直至96h， 实验组的谷草转氨酶活性仍然维持稍高于正常水平。 0077 表3、 各待测样品在不同时间点测得的GOT/UGOT值 0078 GOT/UGOT实验组对照组 2h603.73562.18 4h625.03553.20 8h613.51542.33 12h624.72553.02 24h635.27*513.19 48h631.79*283.60 96h613.55*263.77 0079 注： 数据表示为平均值标准差(n6)， *表示与对照组比较P0.05。 0080

31、(3)酸性磷酸酶(ACP)的检测 0081 酸性磷酸酶作为动物体内重要的调控酶， 也常用ACP作为评价动物免疫功能的指 标。 所测样品在不同时间点测得的具体酸性磷酸酶值见表4， 变化趋势见图4。 0082 表4、 各待测样品在不同时间点测得的ACP值 0083 ACP/UACP实验组对照组 2h8.91.918.81.72 4h9.22.138.51.89 8h10.81.87*6.61.60 说 明 书 7/14 页 9 CN 106924449 A 9 12h11.72.76*6.51.59 24h10.72.71*5.91.91 48h10.11.98*5.82.30 96h9.02.3

32、2*5.82.07 0084 注： 数据表示为平均值标准差(n6)， *表示与对照组比较P0.05。 0085 由图4和表4可看出， 防治弧菌病中药组合物在4-12h的ACP逐渐上升， 12-96h逐渐 下降至恢复正常水平， 同时在第12h时达最大值11.7UACP/ml， 相比对照组仅为6.5UACP/ml， ACP活性升高80.0， 具有显著差异(P0.05)； 对照组ACP水平在4-8h逐渐下降， 48h达到最 低值， 均显著低于正常水平。 0086 通过上述分析可知， 本发明防治弧菌病中药组合物能显著提高虾血清中酸性磷酸 酶、 溶菌酶、 谷草转氨酶的活性， 保护机体肝脏免受损害。 00

33、87 实施例7、 预防性实验 0088 共分为4组， 其中一组为对照组， 另外三组为实验组1-3。 每组随机选取健康对虾 160尾， 于水泥养殖池(广东汕尾市红海湾澳龙苗场)中进行网箱(0.16m3)养殖， 盐度28， 水温28， 增氧泵增氧， 养殖7d。 0089 对照组： 按照正常养殖方式进行饲料投喂， 4餐/天， 2.5g/餐， 总投料量为10g， 不添 加任何药物。 实验组： 除正常投料外， 采用 “2+4” 给药模式， 在每天早上第一餐前1h按照本发 明防治弧菌病中药组合物液体剂和颗粒剂重量比4:1进行投喂， 1餐用量为0.8g， 连用2天， 间隔4天后再次给药。 空白组和组合物组每

34、天的饲料投喂总量相同。 在此期间， 考察对虾的 虾体弧菌数量、 体征、 摄食、 增重、 死亡情况。 0090 水体弧菌检测： 实验第1天， 分别从养殖池中进行水体样本采集后， 采用移液器吸 取0.1ml养殖用水原液(另用无菌生理盐水稀释至适当浓度以计数)， 滴至TCBS固体培养基 上， 一次性无菌涂布器均匀涂布， 室温培养24h， 观察、 计算菌落数量。 观察到培养基上有大 量弧菌生长， 确认水体中有大量弧菌。 0091 虾体弧菌检测： 在实验第1天、 第3天、 第6天， 分别从7个实验组中各随机选取10尾 虾， 纯净水浸泡5分钟， 滤纸吸干虾体表面水分， 称重后置组织研磨器中捣碎成匀浆， 移

35、液器 吸取0.1ml匀浆原液(另用无菌生理盐水稀释至适当浓度以计数)至TCBS固体培养基上， 一 次性无菌涂布器均匀涂布， 室温培养24h， 观察、 计算菌落数量。 结果如表5所示。 0092 表5、 各组对虾虾体携带弧菌数(cfu/g) 0093 组别对照组实验组1实验组2实验组3 第1天2.01042.31041.71042.2104 第3天2.51047.01033.01034.5103 第6天3.41041.01044.01036.0103 0094 注： 表示与空白组相比p0.05。 0095 分析表5数据可知， 与对照组相比， 连续给药2天后， 实验物组均表现出明显的体内 抑杀弧菌

36、效果， 显著地降低弧菌数量； 给药第6天， 实验组仍能够较好地抑制对虾体内的弧 菌生长， 维持在较低的数量水平。 0096 对虾体征评价： 观察、 记录各实验组对虾每天的活动行为、 组织器官发育等情况， 说 明 书 8/14 页 10 CN 106924449 A 10 给予打分评价； 其中以第3天、 第6天为关键点进行分析。 具体的体征评分见表6。 第3天、 第6 天对虾体征评分见表7。 0097 表6、 对虾体征评分 0098 0099 注： 总分810分属正常健康虾； 67分为轻度病虾； 45分为中度病虾； 03分为 重度濒死虾。 0100 表7、 各组对虾在第3d、 6d的体征评分 说

37、 明 书 9/14 页 11 CN 106924449 A 11 0101 0102 分析表7数据可知， 各组别对虾的体征评分均在健康范围值(8分)之内， 3个实验 组的评分均高于2个对照组， 但未具有显著性差异。 但是， 对照组对虾在实验第3天换水后均 发生了不同程度的应激反应， 出现红须、 红尾等应激现象， 个别还伴有空胃、 断肠等症状； 而 实验组在体表、 生长、 活力、 肝脏、 肠胃等体征方面均表现得更加健康， 如体表透亮、 反应敏 捷、 肌肉紧实、 胃肠道饱满、 肝脏清晰， 未出现任何不良的应激反应。 0103 摄食情况： 投料后每隔5min观察一次， 统计实验组对虾每天各餐的摄食时

38、间， 具体 见表8。 0104 表8、 各组对虾每天平均摄食时间(min) 0105 0106 0107 分析表8数据可知， 与对照组相比， 给药后， 实验组对虾在食欲方面均得到了不同 程度的提高(特别是给药后的第2天)， 每餐摄食的平均时间减少614min， 摄食速度稍有提 高， 但未具有显著性差异。 0108 死亡统计： 在整个实验过程中， 记录各实验组对虾每天的死亡例数， 统计存活率， 说 明 书 10/14 页 12 CN 106924449 A 12 具体见表9。 0109 表9、 各组对虾每天死亡情况(尾) 0110 组别对照组实验组1实验组2实验组3 第1天0000 第2天010

39、0 第3天0000 第4天4000 第5天0000 第6天0000 存活率96.399.4100.0100.0 0111 分析表9数据可知， 与对照组的存活率96.3相比， 给药后， 实验组的平均存活率 为99.8， 稍有提高， 但未具有显著性差异。 对照组在第3天换水后均发生不同程度的应激 反应， 引发对虾偷死； 而实验组未见任何不良的应激症状。 0112 增重情况： 在实验第1天、 第6天， 分别对各组对虾进行称重， 比较增长速度， 具体见 表10。 0113 表10、 各组对虾平均增重情况(g) 0114 组别对照组实验组1实验组2实验组3 第1天0.1870.1840.1930.184

40、 第6天0.5450.5550.6050.585 增重g/天0.05960.06190.06870.0668 0115 分析表10数据可知， 与对照组的每天平均增重0.0596克相比， 给药后， 实验组每天 的平均增重为0.0658克， 生长速度明显较之提高。 0116 实施例8、 治疗性实验 0117 采用移液器吸取养殖池中养殖用水0.1ml， 滴于TCBS固体培养基上进行涂布， 室温 培养24h； 挑取典型单菌落(菌检为弧菌)于2216E液体培养基中培养20h， 采用麦氏比浊管进 行菌液浓度比对， 同时用无菌生理盐水稀释至适宜浓度。 0118 采用拌料投喂的感染方式， 每克饲料含细菌(溶藻

41、弧菌(Vibrio alginolyticus, V.a)数量为1.0106cfu， 3餐/天， 感染养殖1天后进行给药实验。 对虾感染弧菌病至给药 前， 200尾对虾中， 共计有18尾对虾死亡， 其余均呈现空胃、 断肠或空肠、 活力低迷等病症， 表 明成功建立对虾弧菌感染发病模型。 选取感染成功后南美白对虾选取病症明显的对虾150 尾， 随机分成3组， 分别为对照组、 实验组1、 实验组2组， 每组50尾虾， 置于白色胶桶(0.1m3) 中饲养， 盐度28， 水温26， 增氧泵增氧。 养殖6d。 0119 对照组按照正常养殖方式(3餐/天)进行饲料投喂， 不添加任何药物； 实验组1、 2除

42、了中午正常投喂饲料外， 在每天早上、 下午投喂本发明防治弧菌病中药组合物液体剂和颗 粒剂重量比4:1的混合物， 连用35天。 在此期间， 考察对虾的虾体弧菌数量、 体征、 摄食、 增 重、 死亡情况。 0120 虾体弧菌检测： 在实验第1天、 第3天、 第5天， 从3个实验组别中各随机选取5尾虾， 说 明 书 11/14 页 13 CN 106924449 A 13 纯净水浸泡5分钟， 滤纸吸干虾体表面水分， 称重后置组织研磨器中捣碎成匀浆， 移液器吸 取0.1ml匀浆原液(另用无菌生理盐水稀释至适当浓度以计数)至TCBS固体培养基上， 一次 性无菌涂布器均匀涂布， 室温培养24h， 观察、

43、计算菌落数量， 具体见表11。 0121 表11、 各组对虾虾体携带弧菌数(cfu/g) 0122 组别对照组实验组1实验组2 第1天6.01056.31055.6105 第3天1.21065.61044.0104 第5天1.51079.0103 7.3103 0123 注： 表示与对照组相比p0.05， 表示与对照组相比p0.01。 0124 分析表11数据可知， 各组对虾在感染后第1天的弧菌数均超过105cfu/g， 属于轻中 度发病。 对照组随着养殖天数的增加， 弧菌呈级数递增， 成为重度病虾(106cfu/g)； 实验组 在给药3天后， 均表现出显著地抑制体内弧菌生长作用； 连续给药5

44、天， 实验组的对虾虾体弧 菌数已经降至正常范围值内(104cfu/g)。 0125 对虾体征评分： 观察、 评价各实验组对虾每天的活动行为和组织器官发育情况， 具 体见表1213。 0126 表12、 对照组对虾每天的体征评分 0127 特征1d2d3d4d5d6d 体表111111 生长111100 活力110000 肝脏111000 肠胃100000 总计653211 0128 表13、 实验组1对虾每天的体征评分 0129 体征1d2d3d4d5d6d 体表111111 生长111111 活力122222 肝脏112222 肠胃112222 总计568888 0130 表14、 实验组2

45、对虾每天的体征评分 说 明 书 12/14 页 14 CN 106924449 A 14 0131 0132 0133 分析表1214数据可知， 各组对虾在感染成功后的第1天已处于中度发病状态， 随 着养殖天数的增加， 对照组对虾出现明显的红体、 红须、 红尾、 活力微弱、 空肠空胃、 肝脏萎 缩等病症， 相继死亡； 而实验组1、 实验组2对虾在给药第3天的体表、 生长、 活力、 肝脏、 肠胃 等体征方面均出现明显好转， 给药5天后已恢复到正常指标范围： 体表透亮、 活力强、 胃肠道 饱满、 肝胰腺清晰。 0134 摄食情况： 投喂后观察各组摄食表现， 结果如下： 0135 对照组： 实验第1

46、2天的摄食时间显著延长， 第3天已基本停止摄食。 0136 实验组1： 实验第12天摄食时间延长， 第34天恢复正常摄食。 0137 实验组2： 实验第1天摄食时间延长， 第23天恢复正常摄食。 0138 死亡统计： 在整个实验过程中， 记录每天各实验组对虾死亡例数， 统计存活率， 具 体见表15。 0139 表15、 各组对虾死亡情况(尾) 0140 组别对照组实验组1实验组2 第1天753 第2天1122 第3天1001 第4天1210 第5天310 第6天000 存活率()14.082.0 88.0 0141 注： 表示与对照组相比p0.01。 0142 分析表15数据可知， 与对照组存

47、活率14.0相比， 实验组1和实验组2的存活率为 分别为82.0、 88.0， 均显著地提高了病虾的存活率。 具体表现为： 连续给药2天， 病情已 得到有效控制， 对虾死亡例数显著降低； 给药3天， 已无死虾出现。 0143 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式， 其描述较为具体和详细， 但并 说 明 书 13/14 页 15 CN 106924449 A 15 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。 应当指出的是， 对于本领域的普通技术人员 来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改进， 这些都属于本发明的保 护范围。 因此， 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 说 明 书 14/14 页 16 CN 106924449 A 16 图1 图2 图3 说 明 书 附 图 1/2 页 17 CN 106924449 A 17 图4 说 明 书 附 图 2/2 页 18 CN 106924449 A 18