一种基于金纳米团簇荧光探棒快速检测葡萄糖浓度的方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 103837516 A (43)申请公布日 2014.06.04 CN 103837516 A (21)申请号 201410104398.3 (22)申请日 2014.03.20 G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 南京工业大学 地址 210009 江苏省南京市新模范马路 5 号 (72)发明人 陈萌 马鸿飞 李玉峰 冯大千 王伟 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 32207 代理人 高玲玲 (54) 发明名称 一种基于金纳米团簇荧光探棒快速检测葡萄 糖浓度的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种基于金纳米团簇荧光探棒 快速检测葡萄糖浓度的

2、方法， 以牛血清蛋白功能 化的金纳米团簇为葡萄糖荧光检测探针， 利用共 振光散射技术来检测葡萄糖的浓度。本发明相对 于色谱法及分光光度法使用的仪器成本较低 ； 此 荧光探测制备的原料均具有较高的稳定性， 相对 于生物传感器法检测的稳定性较差的缺点有很大 的改进。 本发明的荧光检测探针灵敏度高、 选择性 好、 检测限低 ； 所用试剂均无毒副作用 ； 本发明方 法简单、 快速、 易操作， 不需要大型仪器。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图5页 (10)申请公布号 C

3、N 103837516 A CN 103837516 A 1/1 页 2 1. 一种基于金纳米团簇荧光探棒快速检测葡萄糖浓度的方法， 其特征在于包括以下步 骤 ： （1） 合成牛血清蛋白功能化的金纳米团簇 ： 将牛血清蛋配置成 50mg/mL 的溶液备用， 将氯金酸配置成 10mmol/L 的溶液避光保存 备用， 取已配好的牛血清蛋白溶液 10mL 与氯金酸溶液 10mL 在避光的条件混合， 在温度为 37的水浴中剧烈搅拌 2 3min， 随后加入 1mol/L 的 1mL 氢氧化钠溶液， 避光恒温反应 12h， 溶液颜色从淡黄色变为浅棕色， 最后变为深棕色， 得到牛血清蛋白功能化的金纳米团

4、簇水溶液， 稀释至 50mL， 将溶液在 4的条件下保存备用 ； （2） 检测牛血清蛋白功能化的金纳米团簇的 LS 强度 ： 将所述牛血清蛋白功能化的金纳米团簇按质量比 1:5 的比例配成水溶液， 取 3mL 加入 到 5mL 的比色管中， 然后在 LS-50B 型荧光分光光度计上以 em =400nm 进行同步扫描激发 和发射单色器获得溶液的 LS 强度， 测定时保持电压为 400V， 狭缝宽度为 10nm ； （3） 共振光散射法检测葡萄糖浓度 ： 将60L的待测溶液和0.6mg/mL 140L葡萄糖氧化酶在37下混合培养10分钟， 加 入到 2.8mL 的金纳米团簇溶液， 混合均匀加入到

5、 5mL 的比色管中， 然后在 LS-50B 型荧光分 光光度计上以em =400nm进行同步扫描激发和发射单色器获得溶液的LS强度， 测定时保 持电压为 400V， 狭缝宽度为 10nm ； 根据线性回归方程为可以获得待测溶液的葡萄糖浓度。 2. 根据权利要求 1 所述的基于金纳米团簇荧光探棒快速检测葡萄糖的方法， 其特征在 于 ： 所述待测溶液为非血清溶液时， 线性回归方程为 F = 44.5c +82.467， 待测溶液为血清 溶液时， 线性回归方程为 F = 52.027c +97.23， 其中 F 表示待测溶液加入金纳米团簇溶液 后在 400nm 处的光散射增加强度， c 表示待测溶

6、液中葡萄糖的浓度。 权 利 要 求 书 CN 103837516 A 2 1/3 页 3 一种基于金纳米团簇荧光探棒快速检测葡萄糖浓度的方法 技术领域 0001 本发明涉及纳米材料应用技术领域， 具体涉及一种基于金纳米团簇荧光探棒对血 样中葡萄糖浓度的灵敏检测方法。 背景技术 0002 葡萄糖是生物体内新陈代谢不可缺少的营养物质， 是活细胞的能量来源和新陈代 谢的中间产物， 在食品分析和临床诊断中有着非常重要的作用。 目前， 已有的检测葡萄糖的 方法很多， 各有利弊。 0003 在所有的葡萄糖的检测方法中， 应用最广的是高效液相色谱法， 该方法中的离子 色谱法在近年发展非常快。 采用气相色谱法

7、分析葡萄糖需经过硅醚化处理， 操作比较复杂。 采用分光光度法分析需加入显色剂。此外， 色谱法及分光光度法使用的仪器成本较高且需 要专业的实验员进行操作， 不适宜发展中国家及偏远地区的普遍使用。鉴于葡萄糖结构的 复杂性， 旋光度法适宜作为一种辅助的检测方法 ； 生物传感器法具有线性检测范围宽、 灵敏 度高等优点， 且成本较低， 有很好的应用前景， 但由于其重现性较差且稳定性不高， 在葡萄 糖的实际检测中应用较少。 0004 色谱法及分光光度法使用的仪器成本较高， 且需专业人员操作 ； 旋光度法只能作 为一种辅助手段定性的检测葡萄糖的简单结构 ； 生物传感器法检测需建微流管道并且受环 境 （温度、

8、 湿度、 气压等） 影响较大， 稳定性差。 0005 因此亟需一种可以快速、 有效检测葡萄糖浓度的方法。 发明内容 0006 本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷， 提供一种快速检测血清中低浓度葡萄 糖浓度的方法。 0007 为了实现上述目的， 本发明采用以下技术方案 ： 一种基于金纳米团簇荧光探棒快 速检测葡萄糖浓度的方法， 包括以下步骤 ： （1） 合成牛血清蛋白功能化的金纳米团簇 ： 将牛血清蛋配置成 50mg/mL 的溶液备用， 将氯金酸配置成 10mmol/L 的溶液避光保存 备用， 取已配好的牛血清蛋白溶液 10mL 与氯金酸溶液 10mL 在避光的条件混合， 在温度为 37的水浴

9、中剧烈搅拌 2 3min， 随后加入 1mol/L 的 1mL 氢氧化钠溶液， 避光恒温反应 12h， 溶液颜色从淡黄色变为浅棕色， 最后变为深棕色， 得到牛血清蛋白功能化的金纳米团 簇水溶液， 稀释至 50mL， 将溶液在 4的条件下保存备用 ； （2） 检测牛血清蛋白功能化的金纳米团簇的 LS 强度 ： 将所述牛血清蛋白功能化的金纳米团簇按质量比 1:5 的比例配成水溶液， 取 3mL 加入 到 5mL 的比色管中， 然后在 LS-50B 型荧光分光光度计上以 em =400nm 进行同步扫描激发 和发射单色器获得溶液的 LS 强度， 测定时保持电压为 400V， 狭缝宽度为 10nm ；

10、 （3） 共振光散射法检测葡萄糖浓度 ： 说 明 书 CN 103837516 A 3 2/3 页 4 将60L的待测溶液和0.6mg/mL 140L葡萄糖氧化酶在37下混合培养10分钟， 加 入到 2.8mL 的金纳米团簇溶液， 混合均匀加入到 5mL 的比色管中， 然后在 LS-50B 型荧光分 光光度计上以em =400nm进行同步扫描激发和发射单色器获得溶液的LS强度， 测定时保 持电压为 400V， 狭缝宽度为 10nm ； 根据线性回归方程为可以获得待测溶液的葡萄糖浓度。 0008 所述待测溶液为非血清溶液时， 线性回归方程为 F = 44.5c +82.467， 待测溶液为 血清

11、溶液时， 线性回归方程为 F = 52.027c +97.23， 其中 F 表示待测溶液加入金纳米团簇 溶液后在 400nm 处的光散射增加强度， c 表示待测溶液中葡萄糖的浓度。 0009 本方法不仅可以通过利用共振光散射技术来检测葡萄糖的浓度， 且可以通过肉眼 大概比较出葡萄糖的浓度高低， 相对于色谱法及分光光度法使用的仪器成本较低 ； 此共振 光探测制备的原料均具有较高的稳定性， 相对于生物传感器法检测的稳定性较差的缺点有 很大的改进。 0010 本发明优点 ：（1） 由于此荧光探针制备的原料均具有较高的稳定性， 因此本检测 方法所使用的金纳米团簇易于制备和保存， 在 4且避光条件下可保

12、存数月。 （2） 本发明检 测方法提供的荧光检测探针灵敏度高、 选择性好、 检测限低。 （3） 本发明和检测过程中所用 试剂均无毒副作用。 （4） 本发明方法简单、 快速、 易操作。将已知浓度的葡萄糖溶液和过量 的葡萄糖氧化酶加入到荧光探针， 通过检测其共振光散射强度的变化， 得出光散射强度与 葡萄糖浓度的标准工作曲线。然后在同样的条件下， 就可以通过测定未知浓度的葡萄糖和 过量的葡萄糖氧化酶加入到该荧光探针后的光散射强度， 就可以从标准工作曲线上查出葡 萄糖的浓度。 附图说明 0011 图 1 牛血清蛋白 （BSA） 为模板功能化的荧光金纳米团簇的激发和发射波长。 0012 图 2 金纳米团

13、簇的高分辨率透射电镜图。 0013 图 3 不同浓度的葡萄糖对 BSA-Au NCs 光散射强度的影响。 0014 图 4 葡萄糖的浓度和光散射强度的线性关系。 0015 图 5 血清中葡萄糖的浓度和 BSA-Au NCs 光散射的强度的线性关系。 具体实施方式 0016 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。 0017 葡萄糖荧光检测探针为牛血清蛋白 （BSA） 为模板功能化的荧光金纳米团簇。 0018 （1） 牛血清蛋白功能化的金纳米团簇 （BSA-Au NCs） 荧光探针的合成 ： 将牛血清蛋 （BSA） 配置成50mg/mL 的溶液备用， 将氯金酸(HAuCl4)配置成10m

14、mol/L的 溶液避光保存备用。取已配好的牛血清蛋白溶液 10mL 与氯金酸溶液 10mL 在避光的条件混 合， 在温度为 37的水浴中剧烈搅拌 2 3min。随后加入 1mL 氢氧化钠溶液 (1mol/L), 避 光恒温反应 12 小时。溶液颜色从淡黄色变为浅棕色 , 最后变为深棕色 ( 图 1)， 得到牛血清 蛋白功能化的金纳米团簇水溶液， 稀释至 50mL， 其浓度为 2.0mmol/L ( 以金原子的数量计 算)， 将溶液在4的条件下保存备用。 在紫外灯 （波长为365nm） 照射下， 牛血清蛋白功能化 的荧光金纳米团簇的水溶液发红光。在波长为 430nm 处激发， 在 620nm 处

15、得到最大发射峰， 图 2 为牛血清蛋白功能化的金纳米团簇的高分辨率透射电镜图， 从图中可以看出其粒径大 说 明 书 CN 103837516 A 4 3/3 页 5 小在 1nm 左右。 0019 （2） 检测牛血清蛋白功能化的金纳米团簇的 LS 强度 ： 由于光散射与介质的不均匀性密切相关， 除了真空之外的其它所有介质都有一定程度 的不均匀性， 所以， 在自然界中光散射现象普遍地存在。因此， 可以利用共振光散射技术对 不同浓度的葡萄糖和牛血清蛋白功能化的金纳米团簇混合后的共振光散射强度变化进行 测试。且经实验表明， 利用共振光散射技术对葡萄糖浓度的检测的灵敏度更高。 0020 共振光散射法检

16、测血清中的葡萄糖是利用葡萄糖在葡糖糖氧化酶参与下催化生 成的双氧水对金簇探针的氧化， 导致其光散射强度变化的原理设计的。在进行分析时一般 采用标准工作曲线法。首先将上述牛血清蛋白功能化的金纳米团簇按质量比 1:5 的比例 配成水溶液， 取 3mL 加入到 5mL 的比色管中， 然后在 LS-50B 型荧光分光光度计上以 (em =ex) 进行同步扫描激发和发射单色器， 测定时保持电压为 400V, 狭缝宽度为 10nm， 最 大散射波长在 400nm 处获得 LS 强度， 记录为曲线 a（图 3） 。 0021 （3） 共振光散射法检测非血清溶液中的葡萄糖浓度 ： 随后取出比色管洗净， 将 6

17、0L 的不同浓度的葡萄糖溶液和 140L 葡萄糖氧化酶 （0.6mg/mL） 在 37下混合培养 10 分钟， 加入到 2.8mL 的金纳米团簇溶液溶液， 混合均匀 加入比色管中， 在 LS-50B 型荧光分光光度计上以相同方法获得 LS 光谱 （曲线 b-j） 。如图 3 所示， 在一定范围内 , 而当加入的葡萄糖的浓度逐渐增大时 , 光散射强度出现明显增强。 图 4 所示葡萄糖的浓度在 0.5M 至 7M 的范围时葡萄糖的浓度和光散射强度有一个良好 关系， 由此可得到葡萄糖的浓度和光散射强度之间的线性回归方程， 该方程为 ： F = 44.5c +82.467， 其中 F 表示加入葡萄糖后

18、 BSA-Au NCs 在 400nm 处的光散射增加强度， c 表示葡 萄糖的浓度。最低检测限可以达到 0.1M。 0022 将 60L 的待测溶液和 0.6mg/mL 140L 葡萄糖氧化酶在 37下混合培养 10 分 钟， 加入到 2.8mL 的金纳米团簇溶液， 混合均匀加入到 5mL 的比色管中， 然后在 LS-50B 型荧 光分光光度计上以em =400nm进行同步扫描激发和发射单色器获得溶液的LS强度， 测定 时保持电压为 400V， 狭缝宽度为 10nm ； 根据线性回归方程为可以获得待测溶液的葡萄糖浓 度。 0023 （4） 共振光散射法检测血清中的葡萄糖浓度 ： 根据同样的步

19、骤， 通过加标法， 利用金纳米团簇合成的葡萄糖荧光检测探针对血清中 的葡萄糖的浓度与光散射的强度之间的关系进行了实验， 测试结果如图 5 所示， 其线性回 归方程为 ： F = 52.027c +97.23， 线性拟合 R 值达到 0.9966。 0024 将 60L 的血清溶液和 0.6mg/mL 140L 葡萄糖氧化酶在 37下混合培养 10 分 钟， 加入到 2.8mL 的金纳米团簇溶液， 混合均匀加入到 5mL 的比色管中， 然后在 LS-50B 型荧 光分光光度计上以em =400nm进行同步扫描激发和发射单色器获得溶液的LS强度， 测定 时保持电压为 400V， 狭缝宽度为 10n

20、m ； 根据线性回归方程为可以获得血清溶液的葡萄糖浓 度。 0025 虽然本发明已以较佳实施例公开如上， 但实施例和附图并不是用来限定本发明， 任何熟悉此技艺者， 在不脱离本发明之精神和范围内， 自当可作各种变化或润饰， 但同样在 本发明的保护范围之内。 因此本发明的保护范围应当以本申请的权利要求保护范围所界定 的为准。 说 明 书 CN 103837516 A 5 1/5 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 103837516 A 6 2/5 页 7 图 2 说 明 书 附 图 CN 103837516 A 7 3/5 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 103837516 A 8 4/5 页 9 图 4 说 明 书 附 图 CN 103837516 A 9 5/5 页 10 图 5 说 明 书 附 图 CN 103837516 A 10