飞龙掌血总生物碱有效部位提取物的制备方法和用途.pdf

1、10申请公布号CN104069218A43申请公布日20141001CN104069218A21申请号201310107380422申请日20130329A61K36/75200601A61P35/0020060171申请人上海中医药大学地址201203上海市浦东新区蔡伦路1200号72发明人朱国福范圣洁高玉琼74专利代理机构上海元一成知识产权代理事务所普通合伙31268代理人吴桂琴54发明名称飞龙掌血总生物碱有效部位提取物的制备方法和用途57摘要本发明属中药制药领域，涉及飞龙掌血总生物碱有效部位提取物的制备方法和用途。本发明以飞龙掌血总生物碱的含量为指标，制备总生物碱含量高、质量可控、稳定、

2、药效显著的飞龙掌血总生物碱提取物；该飞龙掌血总生物碱有效部位提取物中，总生物碱含量50以上。本发明所述的制备方法提纯工艺经济、简便、适用于工业化大生产，制得的提取物具有显著的抑制肿瘤细胞增殖的作用，能诱导肿瘤细胞凋亡，可用于制备抗肿瘤的药物。51INTCL权利要求书1页说明书5页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图1页10申请公布号CN104069218ACN104069218A1/1页21一种飞龙掌血总生物碱有效部位提取物的制备方法，其特征在于，其包括步骤（1）提取飞龙掌血根粉碎后，用5095含水乙醇加热回流提取13次，每次溶媒用量为生药量的6

3、10倍，每次提取时间13H，制得的提取液浓缩成浸膏；（2）纯化将步骤（1）所得浸膏经酸水溶液溶解，调整PH值，使浸膏中生物碱充分溶解于酸水中，得上样液，经树脂吸附，用水淋洗除去杂质，再用醇氨水系统洗脱，将洗脱液浓缩至稠浸膏后真空干燥或除去洗脱液后喷雾干燥，制得飞龙掌血总生物碱有效部位提取物，其中总生物碱含量为50以上。2根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，上样液PH为2至6。3根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，上样液浓度为0055MG生药/ML。4根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，树脂为离子交换树脂。5根据权利要求4所

4、述的制备方法，其特征在于，所述的离子交换树脂选自强酸型、强碱型阳离子交换大孔树脂或凝胶树脂。6根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述离子交换树脂径高比为13112。7根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，洗脱剂选自氨水、乙醇氨水或盐酸。8根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，上样流速为055BV/H，洗脱流速为26BV/H。9权利要求1所述制备方法制得的飞龙掌血总生物碱有效部位提取物在制备抗肿瘤药物中的用途。权利要求书CN104069218A1/5页3飞龙掌血总生物碱有效部位提取物的制备方法和用途技术领域0001本发明属中药制药领域，涉及飞龙掌血

5、总生物碱有效部位提取物的制备方法及药用用途，具体涉及飞龙掌血总生物碱有效部位提取物的制备方法及在制备抗肿瘤药物中的用途。背景技术0002现有技术公开了飞龙掌血是一味收载于苗族、土家族等少数民族药物志中的常用民族药，为芸香科植物飞龙掌血TODDALIAASIATICALAM的干燥根；其味辛、微苦、性温、有小毒，有祛风止痛、散瘀止血、解毒消肿之功。苗医常用该飞龙掌血与白茅根、牛膝、百草霜等配伍，用于治疗风湿痹痛、腰痛、胃痛、痛经、经闭、跌打损伤、劳伤吐血、衄血、瘀滞崩漏、疮痈肿毒等。0003研究显示，所述飞龙掌血中所含有的白屈菜红碱、氯化两面针碱等生物碱成分具有显著的抗肿瘤活性，但含量较低；此外，

6、其总生物碱部分的抗肿瘤作用尚在研究中。0004现有文献1和2中涉及对日本冲绳所产的飞龙掌血中提取的二氢光花椒碱以及其衍生物进行体外抗肿瘤实验，显示上述成分可诱导肺癌（A549）的凋亡，并证实该地区飞龙掌血具有细胞毒性，能诱导肿瘤细胞凋亡。文献3涉及飞龙掌血根皮的镇痛作用；文献4和5涉及到从飞龙掌血中分离鉴定出多个单体，如小叶九里香内酯（MURRAXOCIN）、原阿片碱（PROTOPINE）、8羟基二氢白屈菜红碱（8HYDROXYDIHYDROCHELERYTHRINE）、花椒碱（FAGARINE）、茵芋碱（SKIMMIANINE）、飞龙掌血新双香豆素（TODDALOSIN）、6甲基光叶花椒碱（

7、6METHYLNITIDINE）等。所述文献6中赵丽恋等测定出飞龙掌血根中氯化两面针碱的含量为055MG/G；所述文献7中涉及到采自贵阳不同地区的10批药材的指纹图谱。0005目前，中国专利CN03123772X和CN2007100984481涉及到白屈菜、血水草、博落回和飞龙掌血总生物碱相关的提取及抗肿瘤作用研究；其中，CN03123772X提及上述植物的总生物碱制剂具有抗肿瘤的作用，主要是通过抑制多重药物抗性蛋白（MRP）得以实现。CN2007100984481对CN03123772X的提取纯化工艺进行了改进，采用酸液提取、酸液洗脱；但经本发明人实验证实，传统工艺依然有着高效便捷的优势；首

8、先，选用含水乙醇对药材进行提取；飞龙掌血药材中所含有的生物碱，包括极性较小的生物碱类成分，也包含极性较大的季铵碱类成分，通过对提取溶剂的研究发现，用含水醇作为提取液，加热回流能比酸液提取得到含量更高的生物碱部位，且后期浓缩处理时，水溶液得到的成分中有较多糖类成分，浓缩干燥均具有一定困难；而醇提液可在较低温度下减压回收溶剂，保证所提取的化学成分不会因高温而遭到破坏，又便于浓缩和干燥；其次，CN2007100984481中选择将阳离子交换后的洗脱液改为酸液洗脱，并得到较可观的白屈菜总生物碱分离率；但经本申请的发明人对飞龙掌血总生物碱酸洗脱液和碱洗脱液进行研究发现，酸洗脱液得到的总生物碱含量并未高于

9、碱洗脱液；所述酸洗脱液与生物碱结合形成生物碱盐的同时也与树脂柱上其他离子形成盐而被洗脱，降低了生物碱的纯度；而用碱醇系统进行洗脱，则能得到游离的生物碱，且氨水、乙醇等均易于挥发，不会造说明书CN104069218A2/5页4成杂质的残留，不会引入新的离子。0006本申请的发明人拟提供一种提纯工艺经济、简便、适用于工业化大生产的制备飞龙掌血总生物碱有效部位提取物的方法，且所得提取物具有显著的抑制肿瘤细胞增殖的作用，可用于制备抗肿瘤药物。0007与本发明有关的文献有文献1IWASAKIH,OKABET,TAKARAK,ETALTUMORSELECTIVECYTOTOXICITYOFBENZOCPH

10、ENANTHRIDINEDERIVATIVESFROMTODDALIAASIATICALAMJCANCERCHEMOTHERAPYANDPHARMACOLOGY2010MAR,65471926文献2IWASAKIH,OKABET,TAKARAK,ETALTHETUMORSPECIFICCYTOTOXICITYOFDIHYDRONITIDINEFROMTODDALIAASIATICALAMJCANCERCHEMOTHERAPYANDPHARMACOLOGY,2006NOV,584451459文献3王顺祥,魏经建,等9种中草药镇痛作用的筛选实验J河南中医,2006,2613739文献4楚冬海飞龙掌

11、血化学成分的研究D西北农林科技大学,2008文献5朱克刚飞龙掌血中的生物碱和香豆精J国外医药植物药分册,1980,023233文献6赵丽恋,刘韶,等RPHPLC法测定飞龙掌血中氯化两面针碱的含量J中国实验方剂学杂志,2009,1542628文献7刘志刚,刘晓燕,秦晋颖飞龙掌血的HPLC指纹图谱研究J中药材,2010,33812401243发明内容0008本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种飞龙掌血总生物碱有效部位提取物的制备方法。本发明的制备方法其提纯工艺经济、简便、适用于工业化大生产。0009本发明的另一个目的是提供飞龙掌血总生物碱有效部位提取物在制备抗肿瘤药物中的用途。0010

12、具体的，本发明的飞龙掌血总生物碱有效部位提取物的制备方法，其特征在于，包括步骤（1）提取飞龙掌血根粉碎后，用5095含水乙醇加热回流提取13次，每次溶媒用量约为生药量的610倍，每次提取时间13H，制得的提取液浓缩成浸膏备用；（2）纯化将步骤（1）所得浸膏经酸水溶液溶解，调整PH值，使浸膏中生物碱充分溶解于酸水中，制得上样液，经树脂吸附，用水淋洗除去杂质，再用醇氨水系统洗脱，将洗脱液浓缩至稠浸膏后真空干燥或除去洗脱液后喷雾干燥，制得飞龙掌血总生物碱有效部位提取物，其中总生物碱含量为50以上。0011本发明所述制备方法的步骤（2）中，上样液PH为2至6；本发明所述制备方法的步骤（2）中，上样液浓

13、度为0055MG生药/ML；本发明所述制备方法的步骤（2）中，树脂为离子交换树脂；所述的离子交换树脂选自说明书CN104069218A3/5页5强酸型、强碱型阳离子交换大孔树脂或凝胶树脂；所述离子交换树脂径高比为13112。0012本发明所述制备方法的步骤（2）中，洗脱剂选自氨水、乙醇氨水、盐酸等；所述乙醇氨水为95乙醇氨水；本发明所述制备方法的步骤（2）中，上样流速为055BV/H，洗脱流速为26BV/H。0013本发明中，将所得飞龙掌血总生物碱有效部位提取物进行含量测定以氯化两面针碱为对照品，采用酸性染料比色法测定飞龙掌血提取物中总生物碱的含量；结果显示，飞龙掌血提取物中总生物碱的含量为5

14、0以上，达到有效部位的要求。0014本发明进行了体外抑制人肿瘤细胞A549、AGS、SGC7901、SMMC7721增殖实验，和体内抑制S180荷瘤小鼠肿瘤增殖的实验，结果表明，所制得的提取物在体外能显著抑制人肺癌（A549）、胃癌（SGC7901、AGS）、肝癌（SMMC7721）等人肿瘤细胞的增殖；体内能显著抑制小鼠黑色素瘤S180的增殖，且对小鼠免疫器官没有损伤；通过流式细胞技术、RTPCR、TUNEL等分子生物学手段进行检测，结果显示，所述提取物能改变肿瘤细胞周期，诱导肿瘤细胞凋亡，激活P53以调控一系列细胞凋亡和细胞周期相关基因的表达。0015实验结果还表明，所述的为，所述的提取物能

15、通过上调重要的抑癌基因P53调控P53相关靶基因，进一步证实所述的提取物具有调控肿瘤细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡的作用。0016本发明以飞龙掌血总生物碱的含量为指标，提供了总生物碱含量高、质量可控、稳定、药效显著的飞龙掌血总生物碱提取物；所述的飞龙掌血总生物碱有效部位提取物中，总生物碱含量50以上。0017本发明所述的制备方法中采用传统的碱醇洗脱剂体系进行洗脱，其提纯工艺经济、简便、适用于工业化大生产，所得提取物具有显著的抑制肿瘤细胞增殖的作用，可用于制备抗肿瘤的药物。附图说明0018图1显示了飞龙掌血总生物碱对P53及其靶基因的调控作用。具体实施方式0019通过下面给出的本发明的具体实施例可以

16、进一步清楚地了解本发明，但它们不是对本发明的限定。0020实施例1称取粉碎后的飞龙掌血根50G,用70乙醇浸渍12H后热提2次，每次溶媒用量10倍，每次提取时间为2小时，合并2次提取液，浓缩至稠浸膏，真空干燥,制得本发明的飞龙掌血醇提有效部位提取物，重5091G，通过高效液相测得氯化两面针碱的含量为0183MG。0021实施例2称取粉碎后的飞龙掌血根5G,用70乙醇浸渍12H后热提3次，每次溶媒用量10倍，每次提取时间为60MIN，合并3次提取液，浓缩至稠浸膏，用1MOL/L盐酸调整上样液PH2，上样液浓度为01MG生药/ML，以15BV/H的流速通过30MLD001型阳离子交换大孔树脂，依次

17、用500ML水洗脱除去杂质，再用约为300ML95乙醇氨水（91）洗脱，收说明书CN104069218A4/5页6集洗脱液，浓缩至稠浸膏，真空干燥,制得所述的飞龙掌血总生物碱有效部位提取物，三批样本所得总生物碱在浸膏中的含量如表1所示，表1提取纯化工艺验证序号生药量（G）浸膏量（G）总生物碱得率（）1500002605474425000026758037350000166881770022实施例3体外抑制人肿瘤细胞A549、AGS、SGC7901、SMMC7721增殖实验，将融合为单层生长的肿瘤细胞，用025胰蛋白酶消化，计数并调整细胞浓度为5104CELLS/ML，接种于96孔板，90L/W

18、ELL，同时设阴性对照组、阳性对照组和空白对照组只加培养液，不加细胞和药物，置于37、5CO2培养箱中培养24H后，实验组分别加入不同浓度的受试样品使用液10L，阳性对照组加入不同浓度的5氟尿嘧啶（5FU）使用液10L，阴性对照组和空白对照组均加入10LPBS，继续培养；分别于48H后，每孔加入10L的MTT，继续置培养箱中培养，4H后终止培养，吸去孔内培养上清液，每孔加入150L的DMSO，微量振荡仪震荡10MIN，用酶标检测仪检测并记录490NM处OD值。0023细胞增殖抑制率（阴性对照OD值用药组OD值）/阴性对照OD值100。0024采用SPSS130统计软件计算各样品的IC50值，结

19、果如表2所示，表2本发明所述提取物对体外培养的人肿瘤细胞增殖的影响0025实施例4常规处理传代7天后的肉瘤S180腹水型小鼠，抽吸腹水，置冰盒中，生理盐水调整细胞浓度为1107CELLS/ML。0026取健康昆明种小鼠50只，雌雄各半，适应性饲养3天后，于右前肢腋下，皮下注射02ML/只制备好的瘤株细胞液，得到S180荷瘤移植性肿瘤模型；按计量灌胃本发明制得的提取物的提取液，10天后，常规处理实验鼠，称重后剖取瘤体，结果如表3所示，表3所述提取物对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的影响说明书CN104069218A5/5页7与阴性对照组相比较P005。0027实施例5REALTIMERTPCR研究飞龙

20、掌血总生物碱对A549细胞P53基因及其相关靶基因表达的影响（1）收取细胞取生长状态良好并处于对数生长期的人肺癌细胞株A549，调整细胞浓度2104CELLS/ML，接种于6孔细胞培养板中，置于37，5CO2及饱和湿度的培养箱中培养24H；药物按浓度溶于培养液中，24H后六个孔分别设为阴性对照孔、5FU阳性对照孔、HCPT阳性对照孔、RTATA低浓度（10G/ML）孔、RTATA中浓度（40G/ML）孔、RTATA高浓度（70G/ML）孔；置于培养箱中培养48H后，用细胞刮刀刮取细胞，收集细胞液，离心，弃上层培养液；（2）RNA的提取与检测按RNEASYMINIKIT试剂盒的要求操作，提取RN

21、A后，1琼脂糖凝胶电泳检验RNA质量；（3）反转录按REVERTAIDTMFIRSTSTRANDCDNASYNTHESISKIT试剂盒的操作，反转录得到CDNA；（4）RTPCR扩增引物的选择P53、MDM2、GADD45A、CDKN1A、PCNA、CCND1、BAX、BCL2L1，对照基因为ACTIN；引物的扩增长度均为100BP，结果如图1所示；结果表明，所述各浓度提取物（10G/ML，F10；40G/ML，F40；70G/ML，F70）能上调除MDM2基因外的其他基因；P53基因被飞龙掌血总生物碱有效部位上调后，其负调控基因MDM2的表达被抑制，虽未成明显的量效关系，但与阳性对照组5氟尿嘧啶（5FU）和羟基喜树碱（HCPT）相比，对MDM2基因的表达具有下调作用；其他的基因表达均随提取物浓度的增加而升高，呈明显的量效关系，且高浓度时，其调控基因的能力与阳性对照药物羟基喜树碱相当，尤其是在对P53、CCND1、BCL2L1的调控作用明显超过羟基喜树碱的作用；本实验结果还表明，所述的P53为重要的抑癌基因，所述的飞龙掌血总生物碱有效部位提取物能通过上调该基因来调控P53相关靶基因，结果证实，该提取物具有调控肿瘤细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡等作用。说明书CN104069218A1/1页8图1说明书附图CN104069218A