SIRNA分子组合物及其在治疗病理性瘢痕中的用途.pdf

1、10申请公布号CN104174032A43申请公布日20141203CN104174032A21申请号201410381766922申请日20140806A61K48/00200601A61P17/0220060171申请人上海交通大学医学院附属第九人民医院地址200011上海市黄浦区制造局路639号72发明人周佳刘凯黄晓璐李青峰74专利代理机构上海卓阳知识产权代理事务所普通合伙31262代理人马伟54发明名称SIRNA分子组合物及其在治疗病理性瘢痕中的用途57摘要本发明涉及SIRNA分子组合物及其在治疗增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中的用途。所述的SIRNA分子组合物包含序列为5CCCAAGGGCUA

2、CCAUGCCAACUUCU3的SIRNA分子和5GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU3的SIRNA分子。本发明证实上述SIRNA分子组合物可以促进体外的增生性瘢痕、瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡，还对动物模型中的增生性瘢痕具有良好的治疗效果。51INTCL权利要求书1页说明书9页序列表3页附图8页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书9页序列表3页附图8页10申请公布号CN104174032ACN104174032A1/1页21SIRNA分子组合物，其特征在于，所述的SIRNA分子组合物包含序列为5CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU3的SI

3、RNA分子和序列为5GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU3的SIRNA分子。2根据权利要求1所述的SIRNA分子组合物，其特征在于，所述的SIRNA分子组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。3根据权利要求2所述的SIRNA分子组合物，其特征在于，所述的药学上可接受的载体选自组氨酸和赖氨酸的聚合物。4根据权利要求13所述的SIRNA分子组合物，其特征在于，所述的SIRNA分子组合物治疗增生性瘢痕、瘢痕疙瘩的给药途径包括局部组织注射和局部涂抹结合微针穿刺。5权利要求13所述的SIRNA分子组合物在制备治疗增生性瘢痕、瘢痕疙瘩的药物中的用途。6根据权利要求5所述的用途，其特征

4、在于，所述的治疗增生性瘢痕、瘢痕疙瘩是指消退已形成的增生性瘢痕、瘢痕疙瘩或减小已形成的增生性瘢痕、瘢痕疙瘩的体积。7权利要求13所述的SIRNA分子组合物在制备诱导增生性瘢痕成纤维细胞或瘢痕疙瘩成纤维细胞调亡的药物中的用途。权利要求书CN104174032A1/9页3SIRNA分子组合物及其在治疗病理性瘢痕中的用途技术领域0001本发明涉及分子生物学和基因治疗技术领域，具体地说，是SIRNA分子在治疗增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中的用途。背景技术0002皮肤是人体最大器官，具备防护、免疫、排泄等功能，其中最为重要的功能是防护、维持体内环境的稳态。当皮肤的完整性受到较大破坏时，体内的稳态出现不平衡，外界

5、侵袭因子容易进入体内，直接威胁到个体的生存。在物种进化的过程中，出现了创口的瘢痕愈合模式，这种愈合方式能最快地恢复皮肤的完整性，大大提高了物种的生存机率。因此，瘢痕是人体皮肤创口愈合不可或缺的产物。0003但在创口愈合的过程中常常发生瘢痕的过度生长、异常增殖，形成病理性瘢痕，包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。这些瘢痕通常伴有痛痒症状，影响患者的功能和外观。据文献报道，4070的外科手术术后患者以及91的烧伤患者愈合后形成增生性瘢痕，整形外科门诊通常有超过半数的患者因瘢痕就诊。瘢痕疙瘩临床表现为“蟹足样”浸润性生长，超出原损范围。亚洲人种，尤其是中国人群，是瘢痕疙瘩的高发人群。目前对于增生性瘢痕、瘢痕疙

6、瘩的治疗方法包括手术方法和非手术方法，但都存在一定的局限性。如何改善、治疗病理性瘢痕，一直是整形外科医生关注的课题，同时也是大众关心的问题。0004增生性瘢痕病因主要包括创口张力过大、感染等。增生性瘢痕形成的机制包括成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化、成纤维细胞的增殖、过度血管化、细胞胶原分泌增加以及细胞外基质过度堆积。在增生性瘢痕形成的机制研究中，对TGF（转化生长因子）的研究最多。在TGF的三个亚型中，TGF1与增生性瘢痕的形成关系最为密切，TGF1参与了成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，并促进细胞分泌胶原和组织血管化。已有诸多的实验报道，抑制TGF1的表达可以减轻增生性瘢痕。COX2（环氧合酶2

7、）是PGE（前列腺素E）的前体酶，PGE是炎症反应的重要因子，对血管新生有促进作用。同时TGF1和COX2对于创口愈合过程当中的上皮间质转换都有一定的促进作用。目前关于COX2在治疗增生性瘢痕中的研究较少，关于TGF1和COX2之间的作用也鲜有报道。0005瘢痕疙瘩的主要病理表现是组织内成纤维细胞异常增殖，细胞基质大量沉积的一种皮肤纤维化疾病。瘢痕疙瘩具有侵袭性行为，因此也被视为一种皮肤的良性肿瘤。瘢痕疙瘩的形成机制研究中，TGF1SMAD通路是最主要的促进细胞外基质沉积的通路。瘢痕疙瘩组织纤维化的形成机制复杂，已有诸多的研究，其中有文献报道，瘢痕疙瘩组织中存在EMT上皮间质转化现象。TGF1

8、和COX2均为EMT的重要通路。在肺纤维化、肾脏纤维化疾病研究中，COX2诱导上皮细胞发生EMT，被认为是促进组织纤维化的重要因子。此外，在乳腺癌的研究中发现，COX2诱导EMT现象，导致肿瘤转移。由此，TGF1和COX2与瘢痕疙瘩的形成具有一定的相关性。目前尚未见抑制TGF1和COX2治疗瘢痕疙瘩报道。0006中国专利文献CN2010102602498，申请日20100824，发明名称为“促进皮肤伤说明书CN104174032A2/9页4口无疤痕愈合的SIRNA及应用”，公开了促进皮肤伤口无疤痕愈合的SIRNA分子、靶向多个伤口无疤痕愈合相关基因的多个SIRNA分子的鸡尾酒组合、以SIRNA

9、分子或者其鸡尾酒组合作为有效成分的药物组合物，通过细胞实验以及小鼠和猪皮肤创伤模型证明了该药物组合物可以促进因外伤、外科手术或糖尿病皮肤溃疡等造成的皮肤伤口达到无疤痕愈合，其中SIRNA分子可以靶向那些造成伤口病理性修复或不良反应的基因，SIRNA双链有不同的长度和不同的末端，可以靶向人、小鼠及猪细胞同一基因的同源序列，鸡尾酒组合中的多个SIRNA能同时抑制伤口炎症和血管再生的各种相关基因，药效更显著，药物组合物中组氨酸赖氨酸聚合物、树枝状聚合物或脂质体等药物载体能以纳米颗粒的形式增强SIRNA导入皮肤组织。但是该文献公开的是将SIRNA应用于创口在愈合过程中促进愈合并减少疤痕形成，创口治疗和

10、已形成的瘢痕治疗是完全不同的两个概念，涉及不同的生理过程，而目前关于用SIRNA来治疗已形成的增生性瘢痕、瘢痕疙瘩还未见报道。发明内容0007本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种SIRNA分子组合物。0008本发明另一的目的是，提供上述SIRNA分子组合物的用途以及给药途径。0009为实现上述目的，本发明采取的技术方案是SIRNA分子组合物，所述的SIRNA分子组合物包含序列为5CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU3的SIRNA分子和序列为5GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU3的SIRNA分子。0010优选地，所述的SIRNA分子组合物还包括药学上可接受的

11、载体、稀释剂或赋形剂。0011优选地，所述的药学上可接受的载体选自组氨酸和赖氨酸的聚合物。0012所述的SIRNA分子组合物治疗增生性瘢痕、瘢痕疙瘩的给药途径包括局部组织注射和局部涂抹结合微针穿刺。0013为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是如上所述的SIRNA分子组合物在制备治疗增生性瘢痕、瘢痕疙瘩的药物中的用途。0014所述的治疗增生性瘢痕是指治疗已形成的增生性瘢痕，优选地，所述的治疗增生性瘢痕、瘢痕疙瘩是指消退已形成的增生性瘢痕或减小已形成的增生性瘢痕、瘢痕疙瘩的体积。0015如上所述的SIRNA分子组合物在制备诱导增生性瘢痕成纤维细胞或瘢痕疙瘩成纤维细胞调亡的药物中的用途。00

12、16本文中，所述的“增生性瘢痕”和“瘢痕疙瘩”是指创口愈合的过程中、感染过程中或其他病理过程中发生的瘢痕的过度生长，其机制包括成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化、成纤维细胞的增殖、过度血管化、细胞胶原分泌增加以及细胞外基质过度堆积。只要与上述机制相同的病理过程，均纳入本发明所述的“增生性瘢痕”、“瘢痕疙瘩”的范畴。0017本发明优点在于本发明应用TGF1和COX2联合SIRNA方法，对体外的增生性瘢痕、瘢痕疙瘩成纤维细胞进行TGF1和COX2表达的敲低，可以达到促进成纤维细胞凋亡的效果；此外，在动物模型中，证实TGF1和COX2联合SIRNA对增生性瘢痕的消退具有良好的治疗效果；局部组织注射和局部

13、涂抹结合微针穿刺，是可靠的TGF1和COX2联合SIRNA在体给药途说明书CN104174032A3/9页5径。附图说明0018图1是体外实验中瘢痕成纤维细胞的镜下形态。0019图2是体外实验基因沉默效应检测中目的基因TGF1、COX2MRMA表达情况。0020图3是体外实验基因沉默效应检测中相关目的基因SMA、COL1A1、COL3A1MRMA表达情况。0021图4是体外实验SMA免疫荧光染色结果。0022图5是体外实验ANNEXINV/PI流式细胞凋亡检测结果。0023图6体外实验细胞上清羟脯氨酸含量检测结果。0024图7是是体内实验局部组织注射给药后SIRNA分子荧光检测结果。0025图

14、8是体内外用涂抹结合微针穿刺给药后SIRNA分子荧光检测结果。0026图9是体内实验瘢痕动物模型的瘢痕组织块大体形态结果。0027图10是体内实验瘢痕动物模型的瘢痕组织块体积测量结果。0028图11是体内实验人增生性瘢痕组织块植入模型的瘢痕组织中目的基因TGF1、COX2、SMA、COL1A1的表达情况。0029图12是体内实验瘢痕动物模型的瘢痕组织HE、MASSON染色结果，SMA、CD31、VEGF免疫组化染色结果。0030图13是体内实验瘢痕动物模型的瘢痕组织内羟脯氨酸含量检测结果。0031图14是体内实验瘢痕动物模型的瘢痕组织内成纤维细胞发生凋亡的检测结果。0032图15是体内实验瘢痕

15、动物模型的瘢痕组织内成纤维细胞发生凋亡现象与对照组比较的统计学结果。具体实施方式0033下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。0034实施例11实验材料11SIRNA有效成分TGF1SIRNA分子5CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU3（SEQIDNO1）；COX2SIRNA分子5GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU3（SEQIDNO2）；药物载体缩氨酸（HKP），组氨酸和赖氨酸的聚合物；STP705（SIRNA鸡尾酒）将上述TGF1SIRNA分子、COX2SIRNA分子和HKP形成纳米颗粒，其中TGF1SIRNA分子、COX2SIRNA分子拷贝数比例为

16、11，两种SIRNA分子与HKP的重量比为14。以上药物由苏州圣诺生物有限公司提供。0035抗体兔抗人肌动蛋白（SMA，ALPHASMOOTHMUSCLEACTIN）单克隆抗体（AB5694，ABCAM，IOWA，USA），免疫组化染色一抗稀释比例1200，免疫荧光染色一抗稀释比例1100；兔抗人CD31单克隆抗体（AB38264，ABCAM，IOWA，USA），免疫组化染色一抗稀释比例150；说明书CN104174032A4/9页6兔抗人血管内皮生长因子（VEGF，VASCULARENDOTHELIALGROWTHFACTOR）单克隆抗体（CAT19091，EPITOMICS，CALIFOR

17、NIA，USA），免疫组化染色一抗稀释比例150。0036用引物2实验方法21体外实验211组织标本来源增生性瘢痕组织标本与瘢痕疙瘩组织标本均来源于上海交大附属第九人民医院整形外科住院或门诊患者。0037人瘢痕成纤维细胞分离和培养在手术室无菌条件下将手术切下的增生性瘢痕组织、瘢痕疙瘩组织块去除表皮及皮下脂肪组织，然后在超净工作台上用眼科剪刀将组织剪成大小约051MM3的小块，用025I型胶原酶消化24小时，待组织块消化成絮状后滤网过滤，获取消化分离的细胞。再加入适量含20小牛血清、100U/ML青霉素、100G/ML链霉素的DMEM培养液继续培养，接种于培养皿中，在95空气、5CO2、37的饱

18、和湿度条件下培养。三天换液一次。细胞融合达到90时，传代。0038细胞增殖曲线的测定细胞增殖实验选用增殖状态良好的P3代细胞，细胞计数。96孔板每孔加入100微升2000个细胞。6小时后细胞贴壁，更换培养液，培养液中分别加入STP705、HKP、TGF1SIRNA、COX2SIRNA，药物浓度分别为5G/ML、10G/ML、20G/ML、40G/ML、80G/ML。干预48小时后，吸尽培养液，PBS冲洗3次，每孔加入100L培养液和10LCCK8溶液。说明书CN104174032A5/9页7加入相应量细胞培养液和CCK8溶液但没有加入细胞的孔作为BLANK。在细胞培养箱内继续孵育3小时后，用酶

19、标仪（VARIOSKANFLASH，THERMOELECTRONCO）检测。在波长450NM测定吸光度，各孔数值减去BLANK值，获得绝对吸光值。绘制细胞增殖曲线。0039药物体外干预实验增生性瘢痕成纤维细胞传至第三代，以2106接种于6孔板内。细胞贴壁后换液，加入不同干预因素。设置2组，对照组加入单纯培养液，治疗组在培养液中加入STP705，浓度为10G/ML。干预48小时后进行检测，观察细胞形态。0040沉默效果检测QPCR检测对照组和各实验组在干预48小时后的目的基因TGF1、COX2表达的变化，以及相关目的基因SMA、COL1A1、COL3A1表达的变化。0041SMA免疫荧光染色细胞

20、干预48小时后，吸尽培养皿内培养液。固定4多聚甲醛固定10MIN，然后PBS洗3次，每次5分钟，干燥后选择细胞染色区域，油性笔标记。抗原修复滴加抗原修复液，作用5MIN。透膜加01TRITONX100透膜10MIN，PBS洗三次。封闭10羊血清封闭1H。一抗孵育在细胞表面滴加1100SMA抗体，放在湿盒内，4过夜。一抗孵育完毕，PBS洗涤三次。二抗孵育避光操作，在细胞表面滴加1200羊抗兔二抗，作用30MIN。设置阴性对照组、不加一抗只加二抗组。二抗孵育完毕，PBS洗涤三次。11000DAPI染色1分钟，PBS洗三次。荧光显微镜下观察，拍照。0042细胞凋亡检测干预48小时后，胰蛋白酶消化细胞

21、，终止消化，离心1500RPM、5MIN，调整待检测细胞浓度为106个/ML，取200L，转至流式检测管，1000RPM5MIN（4）。预冷的PBS1ML洗涤两次，1000RPM5MIN（4）。将细胞重悬于60LBINDINGBUFFER，加入4LANNEXINVFITC（20G/ML），轻轻混匀，避光冰上放置15分钟。每个样品临上机前加入4LPI（50G/ML），加BUFFER补足200L，2分钟后迅速检测。0043羟脯氨酸检测实验原理羟脯氨酸在胶原蛋白中占134，在弹性蛋白中占极少量，其它蛋白中均不存在。测量组织、体液、培养液中的羟脯氨酸含量，可以推算出胶原蛋白的含量。0044T氯胺检测法

22、，HYDROXYPROLINECOLORIMETRICASSAYKIT（CATALOGK555100，BIOVISION，USA）。配制T氯胺试剂，每孔6LT氯胺、94L氧化反应缓冲液。配制DMAB（甲基氨基苯甲醛）试剂每孔二甲基氨基苯甲醛50L，高氯酸/异丙醇50L，避光保存。0045标准曲线的绘制配置01MG/ML羟脯氨酸溶液，1MG/ML羟脯氨酸标准品10L加90L双氧水，混匀。分别取0，2,4,6,8,10L1MG/ML羟脯氨酸溶液稀释至100L，制成标准品样本。取10L标准样本加入96孔板内，真空下干燥样本。每孔加入100LT氯胺试剂，室温孵育5分钟，加入100LDMAB试剂，60孵

23、育90分钟。酶标仪560NM下测量吸光度。加入0标准品的孔为BLANK，每孔的读数减去BLANK值。绘制标准曲线。0046上清液样本10L加入90LH2O。100L样本液中加入100L浓HCL，聚四氟乙烯EP管密封，120水解3小时。取10L样本水解也加入96孔板内，真空下干燥样本。每孔加入100LT氯胺试剂，室温孵育5分钟，加入100LDMAB试剂，60孵育90分钟。酶标仪560NM下测量吸光度。每孔的吸光值在标准曲线中换算成羟脯氨酸含量（SA）（单位说明书CN104174032A6/9页8G）。加入96孔板中的样本体积为SV（L），样本中的羟脯氨酸浓度计算CSA/SVG/L。0047体内实

24、验221增生性瘢痕动物模型的建立（1）实验动物实验动物由上海试验动物中心提供，实验动物的使用符合实验动物伦理及实验动物福利条款（伦理审批沪动科伦20127（HDKL20127）。0048（2）组织标本来源组织标本均来源于我院整形外科住院患者，巨乳缩小术中切除标本。标本的使用获得患者的知情同意。0049（3）建立方法全厚皮片移植于裸鼠背部人增生性瘢痕动物模型的建立。将获得的皮肤组织修剪制成全厚皮片，大小2CM16CM。10水合氯醛01ML腹腔注射麻醉裸鼠，胶带固定裸鼠四肢，切除裸鼠背部2CM16CM皮肤，将人全厚皮片移植于裸鼠背部。在植皮术时，将皮片与鼠背深筋膜固定，使皮片与鼠组织形成稳定的接触

25、面，提高皮片的成活率。皮片打棉花包固定，术后2周拆线。术后一个月裸鼠背部形成增生性瘢痕组织。术后一个月左右，实验动物背部形成增生性瘢痕模型。0050体内干预目的基因的沉默效应检测使用瘢痕动物模型进行STP705干预，干预浓度20G/ML。配制浓度为80G/ML的STP705。麻醉动物后，3D扫描仪测量裸鼠背部组织块的体积，单位CM3，按终浓度为20G/ML，换算出80G/MLSTP705的注射量。0051注射方法为了将药物尽可能均匀地注射在组织块内，采用5点法注射。组织块中央一点，均分4个象限各注射一点。药物注射在瘢痕组织块内。0052标本的收集收集单次注射后1天、3天、5天、7天，4个时间点

26、的标本各3个。0053目的基因的检测将收集的组织标本进行QPCR检测，冻存的组织块，用磨头粉碎，在样本中加入TRIZOL裂解，检测TGF1、COX2表达量。0054对检测结果进行分析，得出单次注射的有效时限。0055制定瘢痕动物模型体内干预实验的治疗方案为干预后STP705终浓度为20G/ML，给药3次，每次间隔4天。0056体内给药方式2231注射给药方式建立瘢痕动物模型后，测量瘢痕组织体积，按20G/ML给药浓度计算所需药物剂量。将FAM标记的NCSIRNA分子、HKP的聚合物，分区域均匀注射到瘢痕组织内，采集注射后1小时、24小时、48小时瘢痕组织，冰冻切片后，荧光检测SIRNA分子存留

27、量。FAMNC由吉玛公司合成，NCSEQUENCE5TTCTCCGAACGTGTCACGT3。0057微针穿刺给药方式建立瘢痕动物模型后，在瘢痕组织表面均匀涂抹80G/ML浓度的FAMHKPNC，使用剂量为药物完全浸没瘢痕组织表面。实验组应用15MM微针在瘢痕表皮表面反复穿刺；对照组不穿刺仅涂抹药物。采集各组给药后1小时瘢痕组织标本，冰冻切片后，荧光检测SIRNA说明书CN104174032A7/9页9分子存留量。0058体内干预实验对瘢痕动物模型在组织块植入2周时进行体内干预实验。0059分组设置对照组和实验组，每组4只实验动物。0060处理方法实验组动物瘢痕组织给予浓度为20G/MLSTP

28、705注射给药干预，给药3次，每次间隔4天。对照组动物瘢痕组织块处理方法同实验组，注射20G/MLNC。0061实验结果的记录拍照记录组织大体资料。测量瘢痕组织块体积大小变化。干预后4周两组间瘢痕组织块出现显著性差异。0062组织学检测收集各组干预后4周的组织标本，进行HE染色、MASSON三色染色。0063染色4多聚甲醛固定，脱水透明，浸蜡包埋，冷却凝固成块，切片与贴片。染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。HE染色将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。酸水及氨水中分色，各数秒钟。流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。入70和90酒精中脱水

29、各10分钟。入酒精伊红染色液染色23分钟。脱水透明染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。树胶封片。0064三色染色烤片、脱蜡及水化同HE染色。天青石蓝液染15分钟，自来水冲洗2分钟。苏木素核染15分钟，自来水冲洗2分钟。1盐酸酒精分化，自来水冲洗至镜下观胞核变蓝。复合液（丽春红和酸性复红02冰醋酸19）染20分钟（量为50L/标本）。02醋酸液冲洗2次。磷钨酸分化15分钟，02冰醋酸冲洗2次。亮绿液染15分钟，02醋酸冲洗2次，快速浸入95乙醇、无水乙醇脱水。二甲苯透明，中性树脂封片。0065免疫组化检测收集各组干预后4周的组织标本，进行SMA、VEGF、CD31免疫组化染色。006

30、6组织块的包埋、切片同HE染色。石蜡片脱蜡至水，PBS冲洗3次，每次5分钟。3双氧水510分钟，降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色/RT细胞打孔，PBS冲洗3次，每次5分钟。10羊血清封闭30分钟。一抗4孵育过夜。PBS冲洗2次，每次3分钟。过氧化物酶标记的二抗37孵育30分钟，PBS冲洗2次，每次3分钟。DAB（1MLDDH2ODAB显色试剂盒中试剂ABC各1滴）显色，DAB作用1030分钟，加显色液后随时观察，发现显色后，立即放入水中终止显色。复染苏木素染核，脱水，封片。0067目的基因检测收集各组干预后4周的组织标本，进行QPCR检测。检测目的基因TGF1、COX2表达，以及相关

31、目的基因SMA、COL1A1、COL3A1的表达。进行组间比较。0068羟脯氨酸含量检测收集各组干预后4周的组织标本，进行组织羟脯氨酸含量检测。采用T氯胺法。0069凋亡检测收集各组干预后4周的组织标本，4多聚甲醛固定，石蜡包埋。TUNEL（脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法）染色对组织中的凋亡细胞进行，具体操作步骤按说明进行标本预处理石蜡包埋的组织切片预处理，常规脱蜡、脱水处理。蛋白酶K工作液，室温孵育20分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟。脱氧核糖核苷酸末端转移酶（10）50L和含有核苷酸混合液的反应液试剂450L混合配制TUNEL反应混合液。保留部分含有核苷酸混合液的反应液试剂用

32、作阴性对照。每张切片滴加TUNEL反应混合液50L，370C孵育60说明书CN104174032A8/9页10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟。滴加转化剂POD（酶标记抗荧光素抗体）50L，370C孵育30分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟。滴加DAB一滴，光镜下观察显色结果，及时终止显色。PBS冲洗3次，每次5分钟。苏木素染色3秒，冲洗，中性树胶封片。光镜下观察。0070实验结果31体外实验原代细胞培养后，传至3代，进行体外干预实验。0071通过CCK8检测绘制不同浓度的TGF1SIRNA、COX2SIRNA对细胞增殖的影响，结果显示TGF1SIRNA、COX2SIRNA对体外培养的瘢痕成纤维

33、细胞增殖具有明显的抑制作用，干预效果优于TGF1SIRNA或COX2SIRNA干预效果。适宜的药物干预浓度为10G/ML，干预时间为48小时。0072如图1所示，药物体外干预实验结果为镜下观察空白对照组瘢痕成纤维细胞生长、增殖良好；实验组瘢痕成纤维细胞周边出现小泡状结构，细胞密度低于对照组。0073如图2所示，干预后目的基因的沉默效应TGF1、COX2MRNA表达明显降低，实验组与对照组有显著性统计学差异。0074如图3所示，TGF1、COX2SIRNA干预后，细胞相关目的基因的表达变化QPCR检测结果显示实验组细胞SMA、COL1A1、COL3A1MRNA表达水平明显低于对照组。0075如图

34、4所示，实验组与对照组两组细胞进行ASMA免疫荧光染色，结果显示TGF1SIRNA、COX2SIRNA干预后SMA表达明显低于对照组细胞。0076如图5所示，实验组和对照组细胞应用流式细胞仪进行细胞凋亡检测，实验组细胞存在凋亡现象，空白对照组未见凋亡。0077如图6所示，TGF1SIRNA、COX2SIRNA干预后，实验组细胞分泌胶原的能力明显低于对照组细胞。0078给药方式如图7所示，注射给药方式注射后1小时SIRNA分子沿注射针头扩散致瘢痕组织内；24小时可见SIRNA分子分布在细胞核周围；48小时瘢痕组织内仍有SIRNA分子未降解。0079如图8所示，微针穿刺给药方式实验组可见SIRNA

35、分子通过微孔，进入瘢痕组织真皮层；对照组SIRNA分子无法通过表皮层。0080体内实验如图9所示，对照组、实验组大体比较大体观实验组瘢痕动物模型中的组织块体积较对照组小，组织块表面无充血现象。如图10所示，经测量瘢痕组织块体积大小变化，显示干预后4周对照组和实验组间瘢痕组织块出现显著性差异，且实验组在注射前和注射后瘢痕组织块体积差异显著，表明TGF1SIRNA、COX2SIRNA干预后可显著减小增生性瘢痕。0081如图11所示，干预后四周，对照组和实验组瘢痕组织内TGF1、COX2MRNA表达量经QPCR检测，显示实验组目的基因TGF1、COX2较对照组组织表达明显降低。其它相关目的基因SMA

36、、COLA1MRNA表达量下降。0082如图12所示，HE染色、MASSON三色染色可见治疗组瘢痕组织内细胞成分明显减少，纤维条索断裂、溶解状。VEGF免疫组化染色可见治疗组瘢痕组织内VEGF分泌降低。CD31免疫组化染色可见治疗组瘢痕组织内血管、新生血管减少。0083如图13所示，对照组与实验组瘢痕组织块内胶原含量对比。实验组组织内胶原含说明书CN104174032A109/9页11量明显低于对照组，差异有统计学意义。0084如图14所示，药物干预4周后，实验组瘢痕组织内成纤维细胞凋亡现象增加。如图15所示，实验组与对照组相比，成纤维细胞发生凋亡比率存在统计学差异。0085实施例2比较本发明

37、的SIRNA分子组合物与中国专利文献CN2013105776300中的SIRNA分子组合物（SIRNA分子组合物，所述的SIRNA分子组合物包含核苷酸序列含有A5CCCCGGAGGUGAUUUCCAUCUACAA3，5UUGUAGAUGGAAAUCACCUCCGGGG3的SIRNA分子，和核苷酸序列含有B5GUCUUUGGUCUGGUGCCUGGUCUGA3，5UCAGACCAGGCACCAGACCAAAGAC3的SIRNA分子）在消退增生性瘢痕或瘢痕疙瘩中的效果。0086按照实施例1的方法制备SIRNA鸡尾酒，制备瘢痕动物模型，然后对瘢痕动物模型在组织块植入2周时进行体内干预实验。0087分

38、组设置对照组、CN2013105776300组、本发明组，每组20只实验动物，干预前各组瘢痕动物模型增生性瘢痕大小具有可比性。0088处理方法本发明组动物瘢痕组织给予浓度为20G/MLSTP705注射给药干预，给药3次，每次间隔4天。CN2013105776300组给予浓度20G/MLSIRNA鸡尾酒注射给药干预，处理方法同本发明组。对照组动物瘢痕组织块处理方法同实验组，注射20G/MLNC。0089实验结果记录拍照记录组织大体资料。测量瘢痕组织块体积大小变化。比较干预后4周各组间瘢痕组织块差异。0090结果干预4周前后各组瘢痕组织块体积变化见表1。经显著性分析，本发明组、CN20131057

39、76300组与对照组相比，干预后瘢痕组织块体积均具有显著性差异（P上海交通大学医学院附属第九人民医院SIRNA分子组合物及其在治疗病理性瘢痕中的用途/12PATENTINVERSION33125RNA人工序列1CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU25225RNA人工序列2GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU25320DNA人工序列3TACTACGCCAAGGAGGTCAC20419DNA人工序列4GAGAGCAACACGGGTTCAG19522DNA人工序列5GACCAGTATAAGTGCGATTGTA22621序列表CN104174032A122/3页13DNA人

40、工序列6CCTTGAAGTGGGTAAGTATGT21721DNA人工序列7GGCATTCACGAGACCACCTAC21820DNA人工序列8GGGGCGATGATCTTGATCTT20920DNA人工序列9AGGGCCAAGACGAAGACATC201020DNA人工序列10GTCGGTGGGTGACTCTGAGC201119DNA人工序列11TGAAGGGCAGGGAACAACT191220DNA人工序列12序列表CN104174032A133/3页14GGATGAAGCAGAGCGAGAAG20序列表CN104174032A141/8页15图1说明书附图CN104174032A152/8页16图2图3说明书附图CN104174032A163/8页17图4图5说明书附图CN104174032A174/8页18图6图7说明书附图CN104174032A185/8页19图8图9说明书附图CN104174032A196/8页20图10图11说明书附图CN104174032A207/8页21图12图13说明书附图CN104174032A218/8页22图14图15说明书附图CN104174032A22