一种林蛙提取中药复合制剂及其在治疗及预防脚气的药物中的用途.pdf

1、10申请公布号CN104173868A43申请公布日20141203CN104173868A21申请号201410360711X22申请日20140725A61K36/904200601A61K9/06200601A61K9/12200601A61K8/98200601A61K8/97200601A61P31/10200601A61P17/00200601A61Q19/10200601A61K35/64200601A61K35/5620060171申请人吉林大学地址130012吉林省长春市前进大街2699号72发明人刘艳滕乐生孟庆繁王迪付珧逯家辉李佺李喆张杰刘瑜滕利荣孟令军74专利代理机构长春

2、吉大专利代理有限责任公司22201代理人张景林王恩远54发明名称一种林蛙提取中药复合制剂及其在治疗及预防脚气的药物中的用途57摘要一种林蛙提取中药复合制剂及其在治疗及预防脚气的药物中的用途，属于中药学制剂技术领域。是将林蛙干除杂除尘后粉碎，再加入复合酶水解液，取离心后的上层上清液；将剩余混合物研磨后剪切，喷雾干燥成粉末状，将该超微粉加入到醋酸中超声后纱网过滤，离心后取上清液减压浓缩；从而得到多糖、抗菌肽和钙离子的混合物；将上述物质混合得到林蛙提取混合液，将林蛙提取混合液与复合药物提取液充分混合，得到林蛙提取中药复合制剂。该制剂是中药制剂，无任何副作用，所含短肽胶原蛋白在灰蔸巴多糖的作用下可更好

3、的进入正常细胞，给予细胞充足营养，并可修复受损细胞；抗菌肽可结合钙离子，增强其对真菌细胞壁的破坏，使中药的有效杀菌成分进入真菌细胞达到杀菌效果。51INTCL权利要求书2页说明书16页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书16页附图3页10申请公布号CN104173868ACN104173868A1/2页21一种林蛙提取混合中药复合制剂，其由如下步骤制备得到1君药林蛙提取混合液的制备将4055重量份的林蛙干除杂除尘后分别经20100目粉碎，使林蛙干粉碎物的粒径在500M以下，按照1G110ML的比例加入复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶15WT、胰蛋

4、白酶24WT，风味蛋白酶13WT，酶解温度为5055，酶解时间为12H，酶解PH为7075，而后8590、515MIN灭酶，将混合物在温度1030时离心，离心时间为15MIN，离心转速为20004000RPM，取离心液体积2040的上层上清液；取上清后剩余混合物放入胶体磨，研磨215MIN，使混合物的平均粒径在300M以下；将混合物放入高剪切分散乳化机内，剪切115MIN，使混合物平均粒径在100200M之间，将混合物进行喷雾干燥成粉末状，此时得到剩余混合物的超微粉；将上述超微粉加入到质量浓度为210醋酸中，醋酸与超微粉的体积质量比为1040ML1G；超声575MIN，超声温度为430；经15

5、0M纱网过滤，再向150M纱网上面未过滤物质加入质量体积比为1G18ML的001003MOL/L氢氧化钠，进行微波提取，微波功率为500600W，微波时间39MIN，再次经150M纱网过滤；合并两次滤液，3050，搅拌1030MIN，搅拌速度为100200RPM；搅拌后的滤液离心，离心温度为430，离心时间为240MIN，离心转速为200015000RPM；取上清，减压浓缩，压力为600700托，温度为6570，浓缩体积比为8401；此时得到多糖、抗菌肽和钙离子的混合物；将含有短肽胶原蛋白的上层上清液与多糖、抗菌肽和钙离子混合物混合，得到林蛙提取混合液；2复合药物提取液的制备称取2540重量份

6、灰蔸巴、13重量份苍术、12重量份百部、12重量份藿香，混合后加入质量分数90100的乙醇浸泡110H，其中乙醇与上述物质质量和的体积质量比为120ML1G；100300M纱网过滤，1530、30006000RPM下离心1020MIN，去沉淀后85100下加热浓缩，浓缩体积比为2481；得乙醇提取液；称取13重量份五倍子、13重量份苦参、13重量份马齿苋、12重量份蛇床子、13重量份黄柏、13重量份紫苏、13重量份薄荷叶、13重量份羌活、12重量份防己、13重量份川椒、13重量份白癣皮、12重量份胡黄连、12重量份地肤子、13重量份红花，混合后加入水浸泡124H，其中水与上述物质质量和的体积质

7、量比为1025ML1G，100300M纱网过滤，1530、30007000RPM下离心1020MIN，去沉淀后85100加热浓缩，浓缩体积比为2481，得水提取液；将乙醇提取液与水提取液混合，搅拌1030MIN，搅拌速度为100400RPM，得复合药物提取液；3将林蛙提取混合液与复合药物提取液充分混合，得到林蛙提取中药复合制剂。2权利要求1所述的一种林蛙提取中药复合制剂在制备治疗及预防脚气药物中的用途。3一种治疗及预防脚气的林蛙提取中药复合软膏剂，其由如下步骤制备得到1油相的制备取515重量份石蜡、25重量份单硬脂酸甘油脂、510重量份白凡士林、510重量份液体石蜡、15重量份司盘40、15重

8、量份乳化剂OP、13重权利要求书CN104173868A2/2页3量份对羟基苯甲酸乙酯研磨混匀，得到油相；2林蛙提取中药复合制剂软膏剂的制备将上述油相和权利要求1所述的由4055重量份林蛙干制得的林蛙提取中药复合制剂分别加热至70100，将林蛙提取中药复合制剂加入到所述油相中，边加入边搅拌至冷凝，经纳米匀质机匀质47次，115121灭菌1030MIN；然后将冰片加热到70100过045M膜，无菌条件下与上述灭菌后产物混合均匀，即得到治疗及预防脚气的林蛙提取中药复合软膏剂。4一种治疗及预防脚气的林蛙提取中药复合喷雾剂，其由如下步骤制备得到在权利要求1所述的由4055重量份林蛙干制得的林蛙提取中药

9、复合制剂中依次加入15重量份氯化钠、24重量份PEG400、12重量份苯扎溴铵；100200RPM下搅拌1025MIN，加水至1000ML，150200RPM搅拌1030MIN，使上述物质充分混匀，115121灭菌1020MIN；自体冷却至室温后分装入气雾剂瓶，即得到治疗及预防脚气的林蛙提取中药复合喷雾剂。5一种治疗及预防脚气的林蛙提取中药复合湿巾，其由如下步骤制备得到在权利要求1所述的由4055重量份林蛙干制得的林蛙提取中药复合制剂中依次加入15重量份氯化钠、24重量份PEG400、12重量份苯扎溴铵；100200RPM下搅拌1025MIN，加水至1000ML，150200RPM搅拌1030

10、MIN，使上述物质充分混匀，115121灭菌1020MIN；自体冷却至室温，每5060ML加入到放有1520CM1520CM的无菌无纺布的独立包装袋内，密封即得预防脚气的林蛙提取中药复合湿巾。6一种治疗及预防脚气的林蛙提取中药复合口服制剂，其由如下步骤制备得到1减压浓缩将权利要求1所述的由4055重量份林蛙干制得的林蛙提取中药复合制剂在减压条件下进行蒸馏，压力在81033104帕，温度为5085，浓缩比为151，得浓缩液；2将15重量份醋酸锌缓慢加入到浓缩液中，边加边搅拌；加完后用NAOH调节PH为6265，搅匀后使其自然沉降，自体冷却过夜；3045M滤膜过滤，得澄清液体后，向澄清液中加入51

11、5重量份柠檬酸、525重量份蜂蜜、530重量份白砂糖，在5065、100200RPM下搅拌1025MIN；再次045M滤膜过滤，然后向清液中加入515重量份黄原胶和515重量份山梨酸钾；最后经022M滤膜精滤；4灌装压盖在无菌条件下灌装，压盖封口；5灭菌加热到6265，保持3050MIN，自体冷却至室温，即得到治疗及预防脚气的林蛙提取中药复合口服制剂。权利要求书CN104173868A1/16页4一种林蛙提取中药复合制剂及其在治疗及预防脚气的药物中的用途技术领域0001本发明属于中药学制剂技术领域，具体涉及一种林蛙提取中药复合制剂及其在制备治疗及预防脚气药物中的用途。背景技术0002脚气，是一

12、种极常见的皮肤病。成人中7080的人患有脚气，只是轻重不同而已。常在夏季加重，冬季减轻，也有人终年不愈。致病菌多系毛癣菌属与表皮癣菌种，主要菌种有红色毛癣菌、石膏样毛癣菌、絮状表皮癣菌、玫瑰色毛癣菌。脚气不易治愈的主要原因除去这些真菌有较强的耐药性之外，在治疗过程中，病患处的湿润、厌氧环境又是其剩余真菌的有力温床；同时患者体内含有真菌，当外用停止给药时，体内的真菌可继续繁殖，导致了脚气的反复发作，很难根治。0003目前，国内对林蛙皮抗菌肽进行了研究，申报的专利也在增多，以林蛙为关键词，检索国内外专利，没有查到国外关于林蛙的专利，国内专利中CN1216768A“生物抗菌肽及其制备方法”是涉及一种

13、具有广谱抗菌活性的林蛙蛙皮生物抗菌肽及其制备方法；CN1583166A“林蛙抗菌肽喷雾剂及其制备方法”、CN1583165A“林蛙抗菌肽凝胶剂及其制备方法”是涉及保护林蛙皮肤抗菌肽以喷雾剂和凝胶剂两种形式用于临床皮肤感染、烧伤烫伤感染领域；CN1679632A“林蛙镇痛水提物及其制备方法及其制备方法”是关于保护从林蛙皮中提取的一种具有镇痛作用的林蛙镇痛水提物及其制备技术。均是以林蛙皮为原料，提取了林蛙皮抗菌肽。CN103073628A一种利用超声波从林蛙体中提取抗菌肽的生产制备方法是以林蛙体为原料采用超声提取抗菌肽，提取的抗菌肽是分子量为4KDA最适PH值为35，等电点PI值为80一105的碱

14、性多肽。以上专利均以抗菌肽为保护内容，申请保护其在抗菌方面的作用，所述抗菌是指抵抗细菌和真菌包括大肠杆菌、绿脓杆菌等革兰氏阴性菌和金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌及临床耐药菌克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌、白色念珠菌、酵母菌的一种或多种；并且抗菌治疗途径均为外用给药。CN103432058A“林蛙胶原蛋白液及其制备工艺”是以林蛙皮提取物、西洋参皂甙、五味子浸出液、芦荟提取物和水配制而成；CN102492760A“一种利用复合酶生产活性东北林蛙胶原蛋白低聚肽的方法”是以干东北林蛙皮为原料；CN102229972A“制备林蛙皮胶原蛋白肽的方法”是以林蛙皮为原料，以上三个专利均是以林蛙皮为原料或主要原料提取林

15、蛙皮中所含的胶原蛋白。发明内容0004本发明的目的之一是提供一种林蛙提取混合中药复合制剂，其由如下步骤制备得到00051君药林蛙提取混合液的制备0006将4055重量份的林蛙干除杂除尘后分别经20100目粉碎，使林蛙干粉碎物的粒径在500M以下，按照1G110ML的比例加入复合酶水解液，复合酶水解液中含木说明书CN104173868A2/16页5瓜蛋白酶15WT、胰蛋白酶24WT，风味蛋白酶13WT，酶解温度为5055，酶解时间为12H，酶解PH为7075，而后8590、515MIN灭酶，将混合物在温度1030时离心，离心时间为15MIN，离心转速为20004000RPM，取离心液体积2040

16、的上层上清液，此时上层上清液中含有林蛙干短肽胶原蛋白由于离心力的作用，短链胶原蛋白将集中在上层上清液中，长链蛋白分子将会集中在混合液的中下层剩余混合物中，其分子量为23KDA，等电点PI值为7578，其中碱性氨基酸精氨酸、赖氨酸、组氨酸占上层上清液的11041289质量比，酸性氨基酸天冬氨酸、谷氨酸占上层上清液的17991913质量比。0007取上清后剩余混合物原体积的6080，放入胶体磨，研磨215MIN，使混合物的平均粒径在300M以下；将混合物放入高剪切分散乳化机内，剪切115MIN，使混合物平均粒径在100200M之间，将混合物进行喷雾干燥成粉末状，此时得到林蛙干提取短肽胶原蛋白后剩余

17、纤维、骨质等物质的超微粉；0008将纤维、骨质等物质的超微粉加入到质量浓度为210醋酸中，醋酸与超微粉的体积质量比为1040ML1G；超声575MIN，超声温度为430；经150M纱网过滤，再向150M纱网上面未过滤物质加入质量体积比为1G18ML的001003MOL/L氢氧化钠，进行微波提取，微波功率为500600W，微波时间39MIN，再次经150M纱网过滤；合并两次滤液，3050，搅拌1030MIN，搅拌速度为100200RPM；搅拌后的滤液离心，离心温度为430，离心时间为240MIN，离心转速为200015000RPM；取上清，减压浓缩，压力为600700托，温度为6570，浓缩体积

18、比为8401；此时得到多糖、抗菌肽和钙离子的混合物，其中多糖的分子量为15KDA；抗菌肽的分子量为13KDA，其等电点PI值为7580，且其中碱性氨基酸精氨酸、赖氨酸、组氨酸占多糖、抗菌肽和钙离子的混合物的11281305质量比，酸性氨基酸天冬氨酸、谷氨酸占多糖、抗菌肽和钙离子的混合物的10011147质量比；0009将含有短肽胶原蛋白的上层上清液与多糖、抗菌肽和钙离子混合物混合，从而得到林蛙提取混合液。00102复合药物提取液的制备0011称取2540重量份灰蔸巴、13重量份苍术、12重量份百部、12重量份藿香，混合后加入质量分数90100的乙醇浸泡110H，其中乙醇与上述物质质量和的体积质

19、量比为120ML1G；100300M纱网过滤，1530、30006000RPM下离心1020MIN，去沉淀后85100下加热浓缩，浓缩体积比为2481；得乙醇提取液；0012称取13重量份五倍子、13重量份苦参、13重量份马齿苋、12重量份蛇床子、13重量份黄柏、13重量份紫苏、13重量份薄荷叶、13重量份羌活、12重量份防己、13重量份川椒、13重量份白癣皮、12重量份胡黄连、12重量份地肤子、13重量份红花，混合后加入水浸泡124H，其中水与上述物质质量和的体积质量比为1025ML1G，100300M纱网过滤，1530、30007000RPM下离心1020MIN，去沉淀后85100加热浓缩

20、，浓缩体积比为2481，得水提取液；0013将乙醇提取液与水提取液混合，搅拌1030MIN，搅拌速度为100400RPM，得复合药物提取液；0014将林蛙提取混合液与复合药物提取液充分混合，得到林蛙提取中药复合制剂。说明书CN104173868A3/16页60015所述林蛙提取中药复合制剂可以与药学上可接受的载体或赋形剂形成药物制剂，所述制剂可以为喷雾剂、气雾剂、霜剂、软膏剂、凝胶剂或湿巾等外用剂型。0016所述林蛙提取中药复合制剂可以与药学上可接受的载体或赋形剂形成药物制剂，所述制剂可以为口服液、颗粒剂、混悬液、乳剂等口服剂型。0017本发明的目的之二是提供一种治疗及预防脚气的林蛙提取中药复

21、合软膏剂，其由如下步骤制备得到00181油相的制备取515重量份石蜡、25重量份单硬脂酸甘油脂、510重量份白凡士林、510重量份液体石蜡、15重量份司盘40、15重量份乳化剂OP、13重量份对羟基苯甲酸乙酯研磨混匀，得到油相；00192林蛙提取中药复合制剂软膏剂的制备将上述所述的油相和由4055重量份林蛙干按上述方法制得的林蛙提取中药复合制剂分别加热至70100，将林蛙提取中药复合制剂加入到所述油相中，边加入边搅拌至冷凝，经纳米匀质机匀质47次，115121灭菌1030MIN；然后将冰片加热到70100过045M膜，无菌条件下与上述灭菌后产物混合均匀，即得到林蛙提取中药复合软膏剂。0020用

22、法用量外用，每日早晚两次患部涂敷，13ML/次，7天为1疗程。0021本发明的目的之三是提供一种治疗及预防脚气的林蛙提取中药复合喷雾剂，其由如下步骤制备得到0022在由4055重量份林蛙干按上述方法制得的林蛙提取中药复合制剂中依次加入15重量份氯化钠、24重量份PEG400、12重量份苯扎溴铵；100200RPM下搅拌1025MIN，加水至1000ML，150200RPM搅拌1030MIN，使上述物质充分混匀，115121灭菌1020MIN；自体冷却后分装入气雾剂瓶20ML/瓶，即得治疗及预防脚气的林蛙提取中药复合喷雾剂。0023本发明的目的之四是提供一种治疗及预防脚气的林蛙提取中药复合湿巾，

23、其由如下步骤制备得到0024在由4055重量份林蛙干按上述方法制得的林蛙提取中药复合制剂中依次加入15重量份氯化钠、24重量份PEG400、12重量份苯扎溴铵；100200RPM下搅拌1025MIN，加水至1000ML，150200RPM搅拌1030MIN，使上述物质充分混匀，115121灭菌1020MIN；自体冷却至室温，每5060ML加入到放有1520CM1520CM的无菌无纺布独立包装袋内，密封即得预防脚气的林蛙提取中药复合湿巾。0025本发明的目的之五是提供一种治疗及预防脚气的林蛙提取中药复合口服制剂，其由如下步骤制备得到00261减压浓缩将4055重量份林蛙干按上述方法制得的林蛙提取

24、中药复合制剂在减压条件下进行蒸馏，压力在81033104帕，温度为5085，浓缩比为151，得浓缩液；00272将15重量份醋酸锌缓慢加入到浓缩液中，边加边搅拌；加完后用01MOL/L的NAOH调节PH为6265，搅匀后使其自然沉降，自体冷却过夜；00283045M滤膜过滤，得澄清液体后，向澄清液中加入515重量份柠檬酸、525重量份蜂蜜、530重量份白砂糖，在5065、100200RPM下搅拌1025MIN；045M滤膜过滤，再向清液中加入515重量份黄原胶和515重量份山梨酸钾，最后说明书CN104173868A4/16页7经022M滤膜精滤；00294灌装压盖在无菌条件下灌装，压盖封口；

25、00305灭菌加热到6265，保持3050MIN，自体冷却至常温，即得到治疗及预防脚气的林蛙提取中药复合口服制剂。0031用法用量内服，每日早晚两次口服，20ML/次，7天为1疗程。0032本发明的积极效果在于林蛙提取中药复合制剂是中药制剂，无任何副作用，所含短肽胶原蛋白在灰蔸巴多糖的作用下可更好的进入正常细胞，给予细胞充足营养，并可修复受损细胞；抗菌肽可结合钙离子，增强其对真菌细胞壁的破坏，使五倍子、苦参、马齿苋、蛇床子、黄柏、紫苏、薄荷叶、羌活、防己、川椒、苍术、白癣皮、胡黄连、地肤子、百部、红花、藿香等中药的有效杀菌成分进入真菌细胞达到杀菌效果；灰蔸巴、红花等活血有效成分可与林蛙短肽胶原

26、蛋白一同修复受损细胞。本发明对皮肤粘膜无刺激、杀菌速度快、病灶部位愈合快、使用简便、无色无味，适合不同年龄人群使用。本发明对足部皮肤具有保护作用，提高足部皮肤防御能力，预防脚气的发病率。毒副作用小，标本兼治，疗效显著，临床症状消失迅速，还可起到预防效果。附图说明0033图1林蛙提取混合液中上层上清液中所含短链胶原蛋白凝胶电泳图。0034采用TRICINE电泳法测短肽胶原蛋白分子量，以索莱宝公司的超低分子量蛋白质MARKER作为标准，得出所含短肽胶原蛋白分子量约为23KDA。0035图中左侧为标准的MARKER，即标准分子量蛋白质的电泳图，由左向右依次为实施例一中林蛙提取混合液中上层上清液中所含

27、短链胶原蛋白凝胶电泳图；实施例二中林蛙提取混合液中上层上清液中所含短链胶原蛋白凝胶电泳图；实施例三中林蛙提取混合液中上层上清液中所含短链胶原蛋白凝胶电泳图；实施例四中林蛙提取混合液中上层上清液中所含短链胶原蛋白凝胶电泳图；实施例五中林蛙提取混合液中上层上清液中所含短链胶原蛋白凝胶电泳图。0036图2多糖分子量标准曲线。0037以标准葡聚糖T1分子量1000、T3分子量3000、T5分子量5000、T10分子量10000，蓝葡聚糖分子量2000000为标准品，经SEPHADEXG25凝胶柱100CM15CM以超纯水洗脱，流速为12ML/MIN，254NM检测多糖分子量分布，计算出每种标准葡聚糖糖

28、峰洗脱体积。以分子量为200万的蓝葡聚糖和葡萄糖作为标准糖来确定层析柱的外水体积VO和总体积VT，VE为总体积减去外水体积。以VE/VT为横坐标，LGMW为纵坐标作标准曲线，计算多糖分子量的公式为0038LGMWK1K2VE/VT0039MW多糖分子量；0040VE待测样品的糖峰洗脱体积；0041VO分子筛排阻层析柱的外水体积；0042VT分子筛排阻层析柱的总体积；0043K1、K2为常数。0044以蓝葡聚糖和不同分子量葡萄糖标准制作得出多糖分子量标准曲线；说明书CN104173868A5/16页80045图3林蛙提取混合液所含多糖经SEPHADEXG25凝胶柱层析得到的洗脱曲线。0046采用

29、凝胶层析制备方法检测，用SEPHADEXG25凝胶柱层析254NM下紫外检测仪测定林蛙提取混合液洗脱曲线，得出洗脱体积VE。将洗脱体积VE，带入公式LGMWK1K2VE/VT，根据标准葡聚糖曲线图2所示曲线，算出林蛙提取混合液所含多糖分子量MW约为15KDA。0047图4混合多糖标准RPHPLC分析图谱。0048采用高效液相色谱法测定绘制单糖标准曲线，称取多糖标准样品，加入1ML无水盐酸甲醇，充N2封管后，100水解16H后吹干液体。甲醇解后的多糖标准样品经干燥后，加入2MOL/L三氟乙酸2ML，120充N2封管水解3H，水解产物倒入蒸发皿中，加入适量无水乙醇45水浴蒸除三氟乙酸。PMP柱前衍

30、生化及其处理，取05MLPMP试剂和05ML03MOL/L的NAOH溶液于蒸发皿中，将干燥物溶解后取其中的01ML于小离心管中，70水浴30MIN。进行高效液相检测。0049高效液相色谱分析条件0050仪器SHIMADZULC14ATVP液相色谱仪，附SPD10AVD紫外检测器0051色谱柱DIKMAINERTSILODS3M15046MM0052检测温度350053检测波长245NM0054洗脱液82PBS01M，PH70，18ACETONITRILEV/V0055流速10ML/MIN0056图5林蛙提取液所含多糖组分的RPHPLC分析图谱。0057采用高效液相法分析其单糖组成情况，利用混合

31、多糖的标样确定组分中单糖的比例。林蛙提取混合液中含有的单糖有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸以及半乳糖醛酸，其中鼠李糖甘露糖半乳糖葡萄糖木糖阿拉伯糖岩藻糖的比例约为14612753体积比，糖醛酸含量中葡萄糖醛酸半乳糖醛酸11体积比；0058图6林蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝胶电泳图。0059采用TRICINE电泳法测抗菌肽分子量，以索莱宝公司的超低分子量蛋白质MARKER作为标准，得出所含抗菌肽分子量约为13KDA。0060图中左侧为标准的MARKER，即标准分子量蛋白质的电泳图，由左向右依次为实施例一中林蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝胶电泳图；实施例二中林

32、蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝胶电泳图；实施例三中林蛙提取混合液中上所含抗菌肽分子凝胶电泳图；实施例四中林蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝胶电泳图；实施例五中林蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝胶电泳图。具体实施方式0061下面结合实施例对本发明作进一步描述。本发明所用林蛙干产自是我国东北地区长白山麓。中国林蛙RANATEMPORARIACHENSINENSIS俗称田鸡、哈士蟆、雪哈等，在动物分类上属两栖纲、无尾目、蛙科、蛙属，是我国东北地区长白山麓的特有品种，属于药、食两用的珍贵蛙种，并且资源丰富。说明书CN104173868A6/16页90062实施例一林蛙提取复合中药制剂的制备00631林蛙提

33、取混合液的制备0064取林蛙干40G中国林蛙长白山亚种，购自吉林大药房，除杂除尘后分别经20目、50目、100目粉碎，使林蛙干粉碎物的粒径在500M以下，按照1G6ML的比例加入复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶3WT、胰蛋白酶2WT，风味蛋白酶1WT，酶解温度为52，酶解时间为15H,酶解PH为72，而后87、10MIN灭酶，将混合物在温度25时离心，离心时间为3MIN，离心转速为2500RPM，取总体积25的上层上清液，此时提取了林蛙干中含有的短肽胶原蛋白；0065上层上清液所含胶原蛋白中紫外光谱分析法分析氨基酸类别，氨基酸自动分析仪收集测定氨基酸质量分数精氨酸、赖氨酸、组氨酸的含量

34、占上层上清液的质量百分数分别为312、743、073，天冬氨酸、谷氨酸的含量占上层上清液的质量百分数分别为786、1119。0066取上清后剩余混合物原体积的75，放入胶体磨，研磨3MIN，使混合物的平均粒径在300M以下；将混合物放入高剪切分散乳化机内，剪切2MIN，使混合物平均粒径在100200M之间，将混合物进行喷雾干燥成粉末状，此时得到林蛙干提取短肽胶原蛋白后剩余纤维、骨质等物质的超微粉；0067将纤维、骨质等物质的超微粉加入到质量浓度为4醋酸中，醋酸与超微粉的体积质量比MLG为171。超声，超声时间为30MIN，超声温度为20；过滤，经150M纱网过滤；150M纱网上面未过滤物质加入

35、质量体积比GML为15的002MOL/L氢氧化钠，进行微波提取，微波功率为550W，微波时间4MIN，再次经150M纱网过滤；合并两次滤液，搅拌15MIN，搅拌速度为150RPM；搅拌后的滤液离心，离心温度为20，离心时间为10MIN，离心转速为5000RPM；取上清，减压浓缩，压力为600托，温度为68，浓缩体积比为151；此时得到多糖、抗菌肽、钙离子的混合物钙离子的检测采用EDTA滴定法检测；0068混合物中多糖SEPHADEXG25凝胶柱分离收集单糖，高效液相色谱法测定单糖组成主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸以及半乳糖醛酸组成，其中含单糖鼠李糖甘露

36、糖半乳糖葡萄糖木糖阿拉伯糖岩藻糖约为146121051体积比，糖醛酸含量中葡萄糖醛酸半乳糖醛酸11体积比；0069混合物所含抗菌肽中紫外光谱分析法分析氨基酸类别，氨基酸自动分析仪收集测定氨基酸质量分数精氨酸、赖氨酸、组氨酸的含量占混合物的质量百分数分别为273、816、069，天冬氨酸、谷氨酸的含量占混合物的质量百分数分别为447、598。0070将短肽胶原蛋白、多糖、抗菌肽、钙离子混合，得到林蛙提取混合液956ML，其中含钙离子765MG80MG/100ML。00712复合药物提取液的制备0072称取灰蔸巴29G、苍术3G、百部1G、藿香1G，加入17倍体积MLG的质量分数95的乙醇浸泡2H

37、，200M纱网过滤，25、5000RPM离心15MIN，去沉淀后，98加热浓缩，浓缩体积比为151，得乙醇提取液；称取五倍子2G、苦参1G、马齿苋1G、蛇床子2G、黄柏1G、紫苏1G、薄荷叶2G、羌活1G、防己1G、川椒2G、白癣皮1G、胡黄连1G、地肤子1G、红花1G，加入15倍体积MLG的水浸泡4H，200M纱网过滤，25、5000RPM离心10MIN，去沉淀后，98说明书CN104173868A7/16页10加热浓缩，浓缩体积比为101，得水提取液；将乙醇提取液与水提取液混合，搅拌15MIN，搅拌速度为150RPM，得复合药物提取液；0073将林蛙提取混合液与复合药物提取液充分混合，得到

38、林蛙提取液中药复合制剂，其体积是175ML。0074实施例二林蛙提取中药复合软膏剂的制备00751林蛙提取中药复合制剂的制备0076称取林蛙干40G中国林蛙长白山亚种，购自吉林大药房，灰蔸巴29G购自成都药房，五倍子2G，苦参1G，马齿苋1G，蛇床子2G，黄柏1G，紫苏1G，薄荷叶2G，羌活1G，防己1G，川椒2G，苍术3G，白癣皮1G，胡黄连1G，地肤子1G，百部1G，红花1G，藿香1G以上17味中药均购自吉林大药房，按照实施例一的方法制备成林蛙提取中药复合制剂，体积是175ML。00772油相的制备取石蜡8G，液体石蜡6G，白凡士林12G，单硬脂酸甘油酯10G，司盘409G，乳化剂OP3G

39、，对羟基苯甲酸乙酯1G研磨混匀，得到油相；00783林蛙提取中药复合软膏剂的制备将步骤2制得的油相与林蛙提取中药复合制剂分别加热至90，将林蛙提取中药复合制剂加入到所述油相中，边加边搅拌至冷凝，115灭菌10MIN，冰片1G加热到90过膜，无菌条件下混合均匀，分装，即可。0079实施例三林蛙提取中药复合喷雾剂的制备00801林蛙提取中药复合制剂的制备0081取林蛙干40G中国林蛙长白山亚种，购自吉林大药房，灰蔸巴29G购自成都药房，五倍子2G，苦参1G，马齿苋1G，蛇床子2G，黄柏1G，紫苏1G，薄荷叶2G，羌活1G，防己1G，川椒2G，苍术3G，白癣皮1G，胡黄连1G，地肤子1G，百部1G，

40、红花1G，藿香1G以上17味中药均购自吉林大药房，按照实施例一的方法制备成林蛙提取中药复合制剂，体积是175ML。00822林蛙提取中药复合喷雾剂的制备0083在林蛙提取中药复合制剂中加入PEG44004G、氯化钠5G、苯扎溴铵1G，混匀，150RPM搅拌，搅拌时间为15MIN，加水至1000ML，200RPM搅拌20MIN，使上述物质充分混匀，121灭菌10MIN。自体冷却至室温，分装入气雾剂瓶20ML/瓶，即得。0084实施例四林蛙提取中药复合湿巾的制备00851林蛙提取中药复合制剂的制备0086取林蛙干40G中国林蛙长白山亚种，购自吉林大药房，灰蔸巴29G购自成都药房，五倍子2G，苦参1

41、G，马齿苋1G，蛇床子2G，黄柏1G，紫苏1G，薄荷叶2G，羌活1G，防己1G，川椒2G，苍术3G，白癣皮1G，胡黄连1G，地肤子1G，百部1G，红花1G，藿香1G以上17味中药均购自吉林大药房，按照实施例一的方法制备成林蛙提取中药复合制剂，体积是175ML。00872林蛙提取中药复合湿巾的制备0088在林蛙提取中药复合制剂中加入PEG4003G、氯化钠2G、苯扎溴铵1G，混匀，120RPM搅拌，搅拌时间为14MIN，加水至1000ML，180RPM搅拌19MIN，使上述物质充分混匀，121灭菌10MIN。自体冷却至室温，每50ML加入到放有无菌无纺布15CM15CM独立包装袋内，密封即得。说

42、明书CN104173868A108/16页110089实施例五林蛙提取混合液口服剂型的制备00901林蛙提取混合液的制备0091取林蛙干40G中国林蛙长白山亚种，购自吉林大药房，灰蔸巴29G购自成都药房，五倍子2G，苦参1G，马齿苋1G，蛇床子2G，黄柏1G，紫苏1G，薄荷叶2G，羌活1G，防己1G，川椒2G，苍术3G，白癣皮1G，胡黄连1G，地肤子1G，百部1G，红花1G，藿香1G以上17味中药均购自吉林大药房，按照实施例一的方法制备成林蛙提取中药复合制剂，体积是175ML。00922减压浓缩将林蛙提取中药复合制剂在减压条件下进行蒸馏，压力在92103帕，温度为74，浓缩比为1091，得浓缩

43、液160ML；00933调节混合液0094将研细的醋酸锌缓慢加入林蛙提取混合液中，边加边搅拌；加完后用01MOL/LNAOH调节PH为6401，搅匀后使其自然沉降，自体冷却过夜；00954过滤0096经045M滤膜过滤，得澄清液体后，向澄清液中直接加入5G柠檬酸、10G蜂蜜、18G白砂糖，温度在55时，150RPM搅拌，搅拌时间为15MIN，过滤，再向清液中加入6G黄原胶和5G份山梨酸钾，经022M滤膜精滤；00975灌装压盖0098在无菌条件下灌装，每瓶20ML，压盖封口；00996灭菌0100将灌装好的林蛙提取混合液口服制剂加热到65，保持30MIN，自体冷却至常温即为成品。0101以下试

44、验例表明本发明在治疗脚气药物中的用途0102试验例10103采用完全随机的方法，将780例受试对象分配到治疗组300例，共5组和对照组480例，8组。治疗组分别采用实施例二、实施例三、实施例四、实施例五、实施例二实施例五制成的林蛙提取复合中药制剂，对照组采用新脚气膏市售广州九福堂生物制药、林蛙皮抗菌肽采用CN1216768A方法制备、林蛙体抗菌肽采用CN103073628A方法制备、中药复合制剂A组组成为本发明中去掉林蛙干的外用制剂、中药复合制剂A1组组成为本发明中去掉林蛙干的口服制剂、中药复合制剂B组组成为本发明中去掉林蛙干、灰蔸巴的外用制剂、中药复合制剂C组组成为本发明中去掉林蛙干、五倍子

45、、苦参、蛇床子、防己、苍术的外用制剂、中药复合制剂A中药复合制剂A1组。根据疗效标准判断疗效，结果见表1。0104用法实施例二组、实施例三组、实施例四组、新脚气膏组、林蛙皮抗菌肽组、林蛙体抗菌肽组、中药复合制剂A组、中药复合制剂B组、中药复合制剂C组为外用组，每日早晚两次清洗足部后使用药物，实施例二组每次用药量为2G，用药方式为涂抹足部，2次/D；实施例三组每次用药时喷足部5次，大约为2ML药液，2次/D；实施例四组每次用药时擦拭足部1MIN以上，2次/D；新脚气膏组每次用药量为2G，用药方式为涂抹足部，2次/D；林蛙皮抗菌肽组、林蛙体抗菌肽组、中药复合制剂A组、中药复合制剂B组、中药复合制剂

46、C组，每次用药量为2ML，用药方式为涂抹足部，2次/D；说明书CN104173868A119/16页120105实施例五组、中药复合制剂A1组为口服组；实施例二实施例五组、中药复合制剂A中药复合制剂A1组为外用口服组。实施例五组、中药复合制剂A1组每日早晚口服，每次20ML，服药期间无食物禁忌；实施例二实施例五组每日早晚口服实施例五，每次20ML，并且早晚两次清洗足部后外用实施例二，每次用药量为2G，用药方式为涂抹足部，2次/D；中药复合制剂A中药复合制剂A1组每日早晚口服中药复合制剂A1，每次20ML，并且早晚两次清洗足部后外用中药复合制剂A，每次用药量为2G，用药方式为涂抹足部，2次/D。

47、0106各组同时停用其他相关手段和治疗药物，均以7天为1疗程。0107临床分类主要有糜烂型脚气、水泡型脚气、鳞屑角化型脚气。临床主要症状表现为0108糜烂型趾间潮湿，浸渍发白，干涸脱屑后，剥去皮屑为湿润、潮红的糜烂面或伴有裂口，有奇痒，易继发感染。0109水疱型好发于足缘、足底部，初起为壁厚饱满的小水疱，有的可融合成大疱，疱液透明，周围无红晕。自觉奇痒，搔抓后常因继发感染而引起丹毒、淋巴管炎等。0110鳞屑角化型好发于足跟、足缘部。由于真菌感染引起皮肤干燥、角质粗厚、脱屑，易发生皲裂。本型无水疱及化脓，病程缓慢，多常年不愈，大多数患者由糜烂型、水疱型转化而成。0111统计学方法计量资料用T检验

48、，记数资料用X2及RDIIT检验，P95；显效症状，体征明显改善，积分值减少70；有效症状，体征有好转，积分值减少30；无效症状，体征未见好转，积分值减少30。0114表1本发明治疗脚气的情况例01150116说明书CN104173868A1210/16页130117实验说明在本发明林蛙提取中药复合制剂的治疗下，患者治愈快，疗效明显，复发率极低。说明使用林蛙提取中药复合制剂治疗脚气，比使用林蛙体抗菌肽或林蛙皮抗菌肽、中药复合制剂A、中药复合制剂B、中药复合制剂C、中药复合制剂A1、中药复合制剂A中药复合制剂A1的疗效明显；最重要是使用林蛙提取复合制剂治疗脚气的复发率为1757，极低于使用林蛙皮抗菌肽、林蛙体抗菌肽、中药复合制剂A、中药复合制剂A1的复发率80、82、917、100，低于使用中药复合制剂B、中药复合制剂C、中药复合制剂A中药复合制剂A1的复发率60、567、526。0118试验例20119脚气在夏季潮湿地区多易发病，洗浴工作人员由于长时间在潮湿、通风不良的环境工作，同时客流量大易造成感染，故此洗浴工作人员是高危易感人员。采用完全随机的方法