一种与人源TLR2特异性结合的多肽，其制备方法和用途.pdf

1、10申请公布号CN104098648A43申请公布日20141015CN104098648A21申请号201310113133522申请日20130402C07K7/06200601A61K38/08200601A61P37/02200601A61P19/02200601A61P29/00200601A61P11/00200601A61P35/00200601C12N5/10200601A61K47/4820060171申请人中国医学科学院药物研究所地址100050北京市宣武区南纬路甲2号72发明人李珂吕晓希胡卓伟74专利代理机构北京三高永信知识产权代理有限责任公司11138代理人何文彬54发

2、明名称一种与人源TLR2特异性结合的多肽，其制备方法和用途57摘要本发明公开了一种与人源TLR2特异性结合的多肽，其制备方法和用途。具体而言，本发明的多肽其含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列，或者含有该序列并在其他位置出现氨基酸替换，缺失或添加，且能与TLR2特异性结合。本发明提供了这种多肽序列的制备方法。本发明提供了这类多肽在制备预防和治疗TLR2相关疾病的药物中的应用。优选的TLR2相关疾病选自自身免疫病、慢性炎性疾病、肿瘤。优选的自身免疫病选自类风湿性关节炎；优选的慢性炎性疾病选自慢性阻塞性肺炎。本发明还提供了稳定表达TLR2的阳性细胞HEK293TLR2/TLR1LUC，HEK293

3、TLR2/CD14LUC，HEK293TLR2/TLR6LUC和本发明的多肽作为载体的应用。51INTCL权利要求书1页说明书8页序列表1页附图5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页序列表1页附图5页10申请公布号CN104098648ACN104098648A1/1页21一种多肽，其特征在于，其含有SEQIDNO1所示的氨基酸序列。2一种多肽，其特征在于，含有权利要求1所述氨基酸序列并在其他位置出现氨基酸替换，缺失或添加，且能与TLR2特异性结合。3权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤41经过对阴性细胞和阳性细胞进行有机溶剂法差异筛选

4、，获得能与阳性细胞选择性结合的重组噬菌体；42噬菌体对阴性细胞，阳性细胞以及重组蛋白TLR2结合能力的测定；43单克隆噬菌体的分离制备；44噬菌体基因组单链DNA的提取和获得寡肽序列；45固相多肽合成仪合成获得寡肽序列；46荧光标记的寡肽序列对多种表达TLR2的细胞进行流式细胞术和免疫荧光法测定。4根据权利要求3的制备方法，其特征在于，所述的阴性细胞选自不表达TLR2的HEK293细胞，所述的阳性细胞选自稳定表达TLR2的HEK293细胞。5有机溶剂法差异筛选是经过四轮。6权利要求12中任一项的多肽在制备预防和治疗TLR2相关疾病的药物中的应用。7根据权利要求6的应用，其特征在于，所述的预防和

5、治疗TLR2相关疾病是通过激活TLR2信号通路，促进下游细胞因子的释放。8根据权利要求6的应用，其特征在于，所述的TLR2相关疾病选自自身免疫病、慢性炎性疾病、肿瘤。9根据权利要求8的应用，其特征在于，所述的自身免疫病选自类风湿性关节炎；所述的慢性炎性疾病选自慢性阻塞性肺炎。10稳定表达TLR2的阳性细胞HEK293TLR2/TLR1LUC，HEK293TLR2/CD14LUC，HEK293TLR2/TLR6LUC。11权利要求12中任一项的多肽作为载体的应用。12一种物质，其特征在于，含有权利要求12中任一项的多肽和其他偶联物。13根据权利要求12的药物，其特征在于，所述的其他偶联物选自促进

6、凋亡的多肽。14权利要求12的物质在制备预防和治疗肿瘤的药物中的应用。15一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求12中任一项的多肽。权利要求书CN104098648A1/8页3一种与人源TLR2特异性结合的多肽，其制备方法和用途技术领域0001本发明涉及一种能与人TOLL样受体2（TLR2）结合并且能激活其下游信号通路的多肽，其制备方法和制药用途，属于医药技术领域。背景技术0002TOLL样受体2（TLR2）作为模式识别受体（PATTERNRECOGNITIONRECEPTOR，PRR）中一类重要的受体，能特异地识别侵入体内的微生物病原相关模式分子PAMPS和体内的危险信号相关模式分子PAMPS

7、，激活固有免疫应答，在免疫系统中起关键作用。TLR2主要识别微生物细胞壁的组成成分如细菌的脂肽，脂蛋白和磷壁酸等。研究发现在识别受体的过程中TLR2主要以与CD14、TLR1或TLR6等辅助性受体形成异源二聚体的形式；当特异性配基与细胞膜表面的TLR2结合后，主要通过MYD88信号依赖性通路将信号传至B诱导激酶BINDUCINGKINASE，NIK，NIK的活化导致B激活，B激活后即可启动细胞内炎症因子TNF、IFN、IL6等的合成释放。本实验室前期研究发现TLR2表达与肿瘤的发生发展密切相关，多种肿瘤细胞表面均能检测TLR2的表达，并且TLR2表达量的高低与肿瘤的恶性程度成正相关，例如乳腺癌

8、细胞表面均能检测到TLR2表达，而转移能力高的乳腺癌细胞MDAMB231表面TLR2表达量是低转移能力乳腺癌细胞MCF7的十倍。同时TLR2也参与到其他疾病的发生发展，例如TLR2信号通路与类风湿性关节炎，I型糖尿病，炎性肠炎，慢性阻塞性肺炎，缺血再灌注损伤，动脉粥样硬化，红斑狼疮等多种自身免疫病和慢性炎症密切相关。激活TLR2信号通路，可以促进下游细胞因子TNF、IL6、TGF的释放，细胞因子参与以上疾病的进程。因此从新药研发的角度来看，TLR2可以作为许多疾病的表面标志分子，靶向TLR2进行药物研发具有很好的前景。0003噬菌体随机肽库技术是以以噬菌体展示技术（PHAGEDISPLAY）为

9、基础，通过基因工程手段将外源多肽与噬菌体的次要外壳蛋白P形成融合蛋白展示于噬菌体颗粒表面，可保持相对独立的空间构象和生物活性，而不影响重组噬菌体对宿主菌的感染能力。与其他基因表达系统相比较，噬菌体展示技术的最大特点就是它有效地将被展示多肽或蛋白质和基因偶联起来，构成一个实体，因而在得到某种多肽结构的同时也就获得了它的基因。噬菌体随机肽库技术是一项筛选并获得与靶抗原特异性结合肽的强有力、高通量的新技术，其筛选过程是一个亲和纯化（AFFINITYPURIFICATION）的生物淘选BIOPANNING过程，具体过程是先将噬菌体肽库与靶分子相互作用一段时间，洗涤除去非特异结合噬菌体，将特异性结合噬菌

10、体洗脱下来扩增，然后再投入下一轮的淘选。继续重复淘选、洗脱、扩增，最终淘选出与靶分子特异结合的重组噬菌体克隆。现有噬菌体展示技术通常是对纯化的蛋白进行筛选，得到与该靶蛋白特异性结合的寡肽或抗体，而对于细胞表面的受体而言，纯化的相应蛋白会在空间结构上发生改变，筛选出的寡肽或抗体在体内的结合效应降低，基于此本发明直接利用一对差异表达某种受体的细胞作为筛选的抗原，其中以不表达某种受体的细胞作为阴性细胞，通过阴性筛选去除肽库中与阴性细胞表面相结合的噬菌体，剩余的噬菌体再与表达相应受体的阳性细胞相结合，通过阳性筛选得到与受体相结合的噬菌体，此方说明书CN104098648A2/8页4法即为“体外快速差减

11、筛选BRASIL”噬菌体随机肽库技术，最终获得与相应受体特异性结合的多肽。0004多肽D（KLAKLAK）2是一段带正电并且具有螺旋结构的14个氨基酸序列，能与膜电位较高的细菌等原核微生物细胞膜相结合，提高细菌细胞膜的通透性，造成细胞内基质外流，对细菌造成杀伤力；真核生物的细胞膜电位相比原核生物较低，多肽D（KLAKLAK）2不能与其结合，因此降低了对真核生物的毒性；而在真核生物细胞内线粒体的膜结构与原核生物细胞膜相似，膜电位较高，因此D（KLAKLAK）2可以与线粒体膜相结合，破坏线粒体膜结构，引起线粒体肿胀，造成细胞色素C的释放，进而引发下游CASPASE家族蛋白合成，使真核细胞进入线粒体

12、途径的凋亡。研究报道将多肽D（KLAKLAK）2其上游连接靶向肿瘤细胞的细胞穿膜肽，将其带入肿瘤细胞内，可引发肿瘤细胞进行线粒体途径的凋亡，因此此肽段具有较高的新药开发价值。0005本发明中使用的阴性细胞为细胞膜表面不表达TLR2受体的HEK293细胞系，阳性细胞为本实验室构建的稳定表达TLR2及其辅助性受体CD14、TLR1或TLR6的HEK293细胞系。同时又将TLR2信号通路的报告基因，即B荧光素酶报告基因也稳定表达到以上阴性和阳性细胞系中，作为验证所筛选出的多肽是否具有激活TLR2信号通路功能的细胞平台。发明内容0006本发明的一个实施方案提供了一种多肽，其含有SEQIDNO1所示的氨

13、基酸序列。HISLEUTYRVALSERPROTRP。0007本发明的一个实施方案提供了一种多肽，含有SEQIDNO1所述氨基酸序列并在其他位置出现氨基酸替换，缺失或添加，且能与TLR2特异性结合。0008本发明的一个实施方案提供了上述的多肽的制备方法，包括如下步骤000941经过对阴性细胞和阳性细胞进行有机溶剂法差异筛选，获得能与阳性细胞选择性结合的重组噬菌体；001042噬菌体对阴性细胞，阳性细胞以及重组蛋白TLR2结合能力的测定；001143单克隆噬菌体的分离制备；001244噬菌体基因组单链DNA的提取和获得寡肽序列；001345固相多肽合成仪合成获得寡肽序列；001446荧光标记的寡

14、肽序列对多种表达TLR2的细胞进行流式细胞术和免疫荧光法测定。0015优选的阴性细胞选自不表达TLR2的HEK293细胞，优选的阳性细胞选自稳定表达TLR2的HEK293细胞。所述的有机溶剂法差异筛选优选是经过四轮。0016本发明的一个实施方案提供了上述多肽在制备预防和治疗TLR2相关疾病的药物中的应用。本发明的多肽能和TLR2特异性的结合，由于TLR2信号通路参与许多自身免疫病（例如类风湿性关节炎）及慢性炎症疾病（例如慢性阻塞性肺炎）的发生及发展，激活TLR2信号通路，促进相关细胞因子释放可以抑制以上疾病的进程，该多肽生物学功能在于激活TLR2信号通路和促进相关细胞因子释放，因此其适应症在于

15、治疗以上自身免疫病及慢性炎症疾病。所述的预防和治疗TLR2相关疾病是通过激活TLR2信号通路，促进下游细胞因子说明书CN104098648A3/8页5的释放实现的。优选的TLR2相关疾病选自自身免疫病、慢性炎性疾病、肿瘤。优选的自身免疫病选自类风湿性关节炎；所述的慢性炎性疾病选自慢性阻塞性肺炎。0017本发明的一个实施方案提供了稳定表达TLR2的阳性细胞HEK293TLR2/TLR1LUC，HEK293TLR2/CD14LUC，HEK293TLR2/TLR6LUC。0018本发明的一个实施方案提供了本发明的多肽作为载体的应用。0019本发明的一个实施方案提供了一种物质，这种物质含有本发明的多肽

16、和其他偶联物。本发明的多肽作为载体，能将其他偶联物带入表达TLR2的细胞。优选的其他偶联物可以是各种治疗剂，例如选自促进凋亡的多肽。本发明的多肽和促进凋亡的多肽偶联后能制备预防和治疗肿瘤，尤其是通过靶向TLR2治疗肿瘤。0020本发明的一个实施方案提供了一种试剂盒，含有权利要求12中任一项的多肽。本发明的肽段可以偶联于检测的物质。0021术语及简称0022ELISA酶联免疫吸附试验0023WESTERNBLOT蛋白免疫印迹0024BLASCIDIN杀稻瘟毒素0025CONFOCAL激光免疫共聚焦0026BSA牛血清白蛋白0027FITC异硫氰酸荧光素,一种绿色荧光素。0028DAPI4,6二脒

17、基2苯基吲哚4,6DIAMIDINO2PHENYLINDOLE，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料,常用与荧光显微镜观测。0029VIGOFECT转染试剂的名称0030LUC荧光素酶LUCIFERASE的简称0031MCF7一种低转移乳腺癌细胞的简称0032MDAMB231一种高转移乳腺癌细胞的简称附图说明0033图1构建稳定表达TLR2及其辅助性受体的阳性细胞模型。A为WESTERNBLOT的方法验证所构建的阳性细胞系HEK293TLR2/CD14，HEK293TLR2/TLR1，HEK293TLR2/TLR6中TLR2，CD14，TLR6的表达。B为细胞免疫荧光的方法验证阳性细胞系HEK

18、293TLR2/CD14，HEK293TLR2/TLR1，HEK293TLR2/TLR6中TLR2，CD14，TLR6的表达。0034图2构建稳定表达TLR2信号通路NFKB荧光素酶报告基因的细胞模型HEK293TLR2/CD14/LUC，HEK293TLR2/TLR1/LUC，HEK293TLR2/TLR6/LUC，图2为以上细胞系加入相应配基的量效曲线。0035图3噬菌体ELISA验证所筛选出的噬菌体克隆与阳性细胞的结合。其中左图为阳性细胞ELISA的结果，右图为TLR2重组蛋白ELISA的结果。0036图4流式细胞术的方法验证所筛选肽段与阳性细胞的结合。从上往下依次为FITC标记的多肽与

19、阴性细胞HEK293，阳性细胞HEK293TLR2/TLR1，低表达TLR2的MCF7，高表达TLR2的MDAMB231（MM231）细胞的结合图。0037图5细胞免疫荧光法验所筛选证肽段与表达TLR2细胞的结合。图5中第一排说明书CN104098648A4/8页6为FITC标记的多肽F10与阴性细胞HEK293的结合图，第二排为与阳性细胞HEK293TLR2/TLR1的结合图。0038图6CONFOCAL验证所筛选肽段时间依赖性进入TLR2表达量不同的细胞。图6第一排为高表达TLR2的MDAMB231细胞，第二排为低表达TLR2的MCF7细胞。0039图7荧光素酶活性检测验证所筛选肽段对TL

20、R2信号通路的激活效应。其中左图为所筛选肽段对阴性细胞HEK293LUC的激活效应，右图为所筛选肽段对阳性细胞HEK293TLR2/TLR1/LUC的激活效应。0040图8ELISA检测验证所筛选肽段对TLR2信号通路下游细胞因子的激活效应。以多肽F10为例，其中A图为阴性细胞HEK293和阳性细胞HEK293TLR2/TLR1细胞经所筛选肽段刺激后培养基上清中细胞因子TNF、IL6的含量。B图为MCF7和MDAMB231细胞经所筛选肽段刺激后培养基上清中细胞因子TNF、IL6、TGF的含量。图中CON为空白对照，PAM3为阳性对照PAM3CSK4。0041图9细胞活力实验检测以所筛选肽段为基

21、础加上多肽DKLAKLAK2后对乳腺癌细胞MCF7和MDAMB231细胞的毒性作用。0042图10流式细胞术检测以所筛选肽段为基础加上多肽DKLAKLAK2后对乳腺癌细胞MCF7和MDAMB231细胞的促凋亡作用。具体实施方式0043以下通过SEQIDNO1多肽筛选，鉴定及应用优选实施例并结合附图具体说明本发明的各个方面和特征。本领域的技术人员应该理解，这些实施例只是用于说明目的，而不限制本发明的范围。本发明的保护范围只受权利要求书的限制。在不背离权利要求书范围的条件下。本领域的技术人员可以对本发明的各个方面进行各种修改和改进，这些修改和改进也属于本发明的保护范围。0044另外，需要注意的是，

22、除非特别指明，下面实施例中所用的各种材料和试剂都是本领域中常用的材料和试剂，可以通过常规的商业途径获得；所用方法均为本领域技术人员公知的常规方法或按照厂商所建议的条件。0045实施例1构建稳定表达TLR2及其辅助性受体CD14、TLR1或TLR6的阳性细胞。0046构建方法如下将TLR2及其辅助性受体CD14、TLR1或TLR6的表达质粒PUNOTLR2/CD14，PUNOTLR2/TLR1,PUNOTLR2/TLR6用威格拉斯转染试剂VIGOFECT转染到HEK293中，转染前24小时，接种适量HEK293细胞。至转染时细胞密度以4060为宜。转染前1小时，更换新鲜的完全培养液，置37，5C

23、O2培养。取58GDNA加入稀释液中至总体积为100L，轻轻混匀，室温放置。取VIGOFECT4L加入稀释液中至总体积为100L，轻轻混匀，室温放置5分钟。将稀释的VIGOFECT逐滴加入稀释的DNA溶液中，轻轻混匀，所得的转染工作液在室温放置15分钟。将转染工作液轻轻混匀，逐滴加入5ML培养液中，轻轻混匀培养液，置37，5CO2培养。48小时后，培养基中加入BLASCIDIN抗生素，维持培养两到三周，有限稀释法挑取单个细胞克隆。WESTERNBLOT和细胞免疫荧光的方法验证TLR2及其辅助性受体CD14、TLR1或TLR6在HEK293的表达。所构建细胞系分别为HEK293TLR2/TLR1

24、,HEK293TLR2/TLR6，HEK293TLR2/CD14，结果见图1，显示所构建的细胞系均成功表达了TLR2，TLR1，CD14及TLR6。说明书CN104098648A5/8页70047实施例2构建稳定表达TLR2信号通路NFKB荧光素酶报告基因的细胞。0048在实施例1中HEK293TLR2/TLR1,HEK293TLR2/TLR6，0049HEK293TLR2/CD14细胞的基础上，转染TLR2信号通路NFKB荧光素酶报告基因质粒，转染24小时后培养基中加入抗生素G418，筛选两周后挑选单克隆，化学发光法验证TLR2特异性配基对其信号通路的激活作用。所构建细胞系分别为HEK293

25、TLR2/TLR1/LUC,0050HEK293TLR2/TLR6/LUC，HEK293TLR2/CD14/LUC，分别加入不同浓度的特异性配基刺激（横坐标），相应激活信号通路值用荧光素酶百分比表示，绘制其量效曲线结果见图2。0051实施例3体外快速差减筛选法BRASIL四轮筛选获得能与阳性细胞表面TLR2相结合的重组噬菌体。00521主要试剂0053细胞培养用培养基IMDM，进口胎牛血清FBS，消化用胰酶均购自美国GIBCO公司。0054有机溶剂邻苯二甲酸二甲酯、环己烷购自北京恒业中远化工有限公司，使用配比为苯二甲酸二甲酯环己烷（体积比）91。0055叠氮钠NAN3购自百灵威科技公司。005

26、6溶液A由1BSA，MEM培养基，01NAN3组成。0057随机7肽M13噬菌体展示文库试剂盒购自NEB公司。00582筛选方法005921先进行阴性筛选去除与之相结合的噬菌体，具体为将阴性细胞HEK293细胞（1108个）重悬到600UL溶液A中，21013噬菌体肽库重悬在1ML溶液A中，噬菌体及细胞混合液加至抗原管中，4环境下旋转过夜。006022次日将800UL噬菌体细胞混悬液加至等体积有机溶剂相之上，3000转4离心2分钟，吸取上层水相中的噬菌体，与阳性细胞HEK293TLR2/TLR1（108个，重悬到600UL溶液A）混合，4旋转过夜。006123次日将15ML噬菌体细胞混悬液加至

27、等体积有机溶剂相之上，3000转4离心2分钟，轻轻弃去上层未结合的水相噬菌体，将沉淀下的细胞用200UL溶液A重悬。006224用反复冻融法裂解细胞，释放与细胞表面结合的噬菌体。006325取50UL噬菌体裂解液，用琼脂叠层法测定释放出噬菌体的滴度。006426扩增噬菌体宿主菌ER2738，37摇床扩增至OD值为05，将释放出的噬菌体加至菌液中进行感染扩增。006527扩增后的噬菌体再与阴性细胞结合，进行下一轮筛选。一共经过四轮富集筛选，每一轮从阳性细胞表面洗脱下来的噬菌体量与加入噬菌体量的比值逐渐升高，实现了特异性的富集，结果见表1。0066说明书CN104098648A6/8页8筛选轮数输

28、入值输出值输出/输入值1110125105510723109610421053110941054104431094107131020067表1体外快速差减筛选BRASIL四轮筛选噬菌体展示肽库的结果。0068实施例4噬菌体ELISA验证噬菌体克隆与阳性细胞的结合。0069具体操作步骤如下00701将阴性细胞HEK293及阳性细胞HEK293TLR2/TLR1铺96孔板细胞培养皿，培养过夜，待细胞贴壁后用PBS洗一遍。00712将人TLR2重组蛋白及牛血清白蛋白（BSA）用PBS稀释至10UG/ML，每孔添加100UL，4包被96孔ELISA板过夜。用含有01TWEEN20PBS洗三次。0072

29、321及22中每孔用200UL封闭液（10牛血清PBS）37封闭1H。00734甩掉封闭液，每孔对应加入噬菌体溶液200UL，及50UL封闭液。37孵育1H00745用含有01TWEEN20PBS洗五次。00756每孔加入100UL用封闭液14000稀释后的抗M13单克隆抗体，室温孵育1H。00767用含有01TWEEN20PBS洗六次。00778配制底物显色液（100MMOL/L乙酸钠，PH60，每50ML缓冲液加入10UL30过氧化氢，100UG/MLTMB），每孔加入100UL，室温孵育5MIN。00789每孔加入50UL01M稀硫酸，终止反应。007910测定OD450，并以OD450

30、的值作为最后检测结果0080选择与阳性细胞HEK293TLR2/TLR1、重组蛋白TLR2结合比较高的噬菌体克隆E5、F7、C8、F10、F11、E6（结果见图3）进行单链DNA的提取，然后送上海生工进行测序。0081实施例5噬菌体单链DNA的提取及7肽序列的获得。0082对实施例4中的噬菌体克隆进行单链DNA的提取，操作步骤依次为00831将阳性克隆E5、F7、C8、F10、F11、E6用牙签挑取，加入到对数中期的大肠杆菌ER2738中。0084237摇床（250转）培养455H。00853扩增产物12000转每分钟离心15分钟，取上清加到1/6体积的PEG/NACL溶液，4沉淀过夜。008

31、6412000转每分钟离心15分钟，弃上清，沉淀的噬菌体重悬于200UL碘化钠缓冲液（10MMOL/LTRISHCL，PH80,1MMOL/LEDTA,4MOL/LNAI,室温避光保存）中，加入500UL无水乙醇，室温孵育10分钟。0087512000转每分钟离心15分钟，弃上清，用70乙醇洗沉淀。0088612000转每分钟离心15分钟，弃上清，重悬沉淀与30UL去离子水中。用NEB通用测序引物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。测序结果说明书CN104098648A7/8页9用PRIMEPRIMIER5软件翻译，得到多肽序列，发现六条多肽的氨基酸序列相同，为HISLEUTYRVAL

32、SERPROTRP。0089实施例6阳性噬菌体多肽F10序列的合成及修饰。0090将实施例5中多肽序列HISLEUTYRVALSERPROTRP（多肽F10）及阴性对照（来源于筛选过程中不与阳性细胞结合的噬菌体克隆）多肽序列ALAALATYRVALALAPROALA送北京赛百盛基因技术有限公司按照常规方法进行多肽合成，并且将阴性对照序列及多肽F10其N段进行FITC修饰，以便在细胞水平上进一步验证。0091实施例7流式细胞术法验证化学合成寡肽段与表达TLR2细胞的结合。0092对实施例6中FITC标记的多肽F10进行流式细胞术法检测，具体操作如下00931将对数生长期阴性细胞HEK293、阳性

33、细胞HEK293TLR2/TLR1、低表达TLR2的MCF7、高表达TLR2的MDAMB231（MM231）细胞铺24孔板，培养过夜待细胞贴壁。00942次日，将以上细胞换成无血清培养基，每孔中加入01MM的F10FITC。00953加药孵育24小时后，PBS洗5遍，用无EDTA胰酶将细胞消化下来。00964500G每分钟离心5分钟，将细胞沉淀下来，待上流式细胞仪测定用，结果见图4，显示与阴性多肽FITC相比较，阳性多肽F10FITC能特异性与阳性细胞HEK293TLR2/TLR1，高表达TLR2的MM231细胞相结合。0097实施例8细胞免疫荧光法验证化学合成肽段与表达TLR2细胞的结合。0

34、098对实施例6中FITC标记的多肽F10进行细胞免疫荧光法检测，具体操作如下00991将对数生长期阴性细胞HEK293、阳性细胞HEK293TLR2/TLR1细胞铺预先放圆玻片（多聚赖氨酸处理）的12孔板，培养过夜待细胞贴壁。01002次日，将以上细胞换成无血清培养基，每孔中加入01MM的F10FITC。01013加药孵育24小时后，PBS洗5遍。01024将圆玻片从孔板中取出，用含有抗淬灭剂的细胞核染料DAPI封片。01035待片子风干后用荧光显微镜拍照测定，结果见图5，对比阴性细胞HEK293，F10FITC可以与表达TLR2的阳性细胞HEK293TLR2/TLR1结合。0104实施例9

35、CONFOCAL方法验证肽段时间依赖性进入TLR2表达量不同的细胞0105对实施例5中FITC标记的多肽F10进行CONFOCAL检测，具体操作如下01061将对数生长期低表达TLR2的MCF7、高表达TLR2的MDAMB231细胞铺预先放圆玻片（多聚赖氨酸处理）的12孔板，培养过夜待细胞贴壁。01072次日，将以上细胞换成无血清培养基，分别在10分钟、30分钟、1小时、6小时、12小时和24小时加入F10FITC。01083PBS洗5遍。01094将圆玻片从孔板中取出，用含有抗淬灭剂的DAPI封片。01105待片子风干后用CONFOCAL观测多肽在不同时间进入细胞，结果见图6。F10FITC

36、可以时间依赖性进入TLR2表达量不同的乳腺癌细胞。0111实施例10荧光素酶活性检测验证肽段对TLR2信号通路的激活效应。01121将对数生长期稳定表达B荧光素酶报告基因的阴性细胞HEK293LUC、HEK293TLR2/TLR1/LUC，铺96孔板，培养过夜。01132将1MM多肽F10分别加入以上细胞中，培养8小时，实验设置复孔，空白孔作为说明书CN104098648A8/8页10阴性对照，阳性对照分别为TNF和脂蛋白PAM3CSK4（购自INVIVOGEN公司）。01143用PROMEGA公司的荧光素酶检测试剂盒裂解细胞，GLOMAXTM发光检测仪检测每个孔的数值，结果如图7所示，横坐标

37、分别为空白阴性对照，阳性对照TNF和PAM3CSK4，对照多肽及F10，纵坐标为荧光素酶数值，结果显示多肽F10可以特异性激活细胞HEK293TLR2/TLR1/LUC，而对HEK293LUC细胞则无作用，说明F10对TLR2受体作用的特异性。0115实施例11ELISA检测验证肽段对TLR2信号通路下游细胞因子的激活效应。01161将稳定表达B荧光素酶报告基因的阴性细胞HEK293LUC、HEK293TLR2/TLR1/LUC、低表达TLR2的MCF7、高表达TLR2的MDAMB231细胞，铺96孔板，培养过夜。01172将1MM多肽F10分别加入以上细胞中，培养过夜，实验设置复孔，空白孔作

38、为阴性对照，阳性对照为脂蛋白PAM3CSK4。01183次日收集细胞上清，利用商业化TNF、IL6、TGF细胞因子检测试剂盒（EBIOSCIENCE），检测每孔细胞TNF、IL6、TGF的表达量，结果如图8所示。多肽F10可以促进TLR2信号通路下游细胞因子TNF、IL6、TGF的释放。0119实施例12细胞活力检测所筛选肽段为基础的新的肽段F10D（KLAKLAK）2对乳腺癌细胞MDAMB231和MCF7的抑制细胞活力作用。01201将低表达TLR2的MCF7、高表达TLR2的MDAMB231细胞，铺96孔板，培养过夜。01212将10，20，30，50，80，100M不同浓度多肽F10D（

39、KLAKLAK）2分别加入以上细胞中，培养过夜，实验设置复孔，D（KLAKLAK）2加药孔作为阴性对照。01223次日收集细胞，利用商业化细胞活力检测试剂盒（PROMEGA），检测细胞活力的百分比，结果如图9所示，D（KLAKLAK）2对细胞活力无影响，肽段F10D（KLAKLAK）2可以差异性抑制乳腺癌细胞MDAMB231和MCF7的细胞活力0123实施例13流式细胞术检测新的肽段F10D（KLAKLAK）2对乳腺癌细胞MDAMB231和MCF7细胞的促凋亡作用。01241将低表达TLR2的MCF7、高表达TLR2的MDAMB231细胞，铺12孔板，培养过夜。01252将不同浓度01M,5M

40、多肽F10D（KLAKLAK）2分别加入以上细胞中，培养过夜，实验设置复孔，D（KLAKLAK）2加药孔作为阴性对照。01263次日收集细胞，利用商业化凋亡检测试剂盒（南京凯基生物），流式检测凋亡细胞的百分比，结果如图10所示，D（KLAKLAK）2对两种乳腺癌细胞均没有促进凋亡作用，F10DKLAKLAK对高表达TLR2的MDAMB231细胞促凋亡作用则比较明显。说明肽段F10D（KLAKLAK）2可以差异性促进乳腺癌细胞MDAMB231和MCF7发生凋亡。说明书CN104098648A101/1页110001序列表CN104098648A111/5页12图1图2图3说明书附图CN104098648A122/5页13图4图5说明书附图CN104098648A133/5页14图6图7说明书附图CN104098648A144/5页15图8图9说明书附图CN104098648A155/5页16图10说明书附图CN104098648A16