七叶胆苷ⅩⅦ在制备用于防治心脑血管及神经退行性疾病药物中的应用.pdf

1、(10)申请公布号 CN 103933052 A (43)申请公布日 2014.07.23 CN 103933052 A (21)申请号 201410003649.9 (22)申请日 2014.01.04 A61K 31/704(2006.01) A61P 9/00(2006.01) A61P 9/10(2006.01) A61P 25/28(2006.01) A61P 25/16(2006.01) (71)申请人 中国医学科学院药用植物研究所 地址 100193 北京市海淀区马连洼北路 151 号 (72)发明人 孙晓波 孙桂波 孟详宝 (74)专利代理机构 北京三聚阳光知识产权代理 有限公

2、司 11250 代理人 李红团 (54) 发明名称 七叶胆苷在制备用于防治心脑血管及神 经退行性疾病药物中的应用 (57) 摘要 本发明公开了七叶胆苷 的药物新用途， 具体地公开了七叶胆苷 在制备治疗包括脑 缺血性疾病、 脑缺血再灌注损伤、 氧化应激性脑损 伤等在内的心脑血管疾病和包括老年痴呆、 帕金 森等在内的神经退行性疾病的药物中的用途。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 11 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书11页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103933052 A CN 103933052 A

3、 1/1 页 2 1. 七叶胆苷 或其药学上可接受的盐在制备防治心脑血管疾病的药物中的应用， 其中心脑血管疾病包括例如脑缺血性疾病、 脑缺血再灌注损伤、 氧化应激性脑损伤等疾病。 2. 七叶胆苷 或其药学上可接受的盐在制备防治神经退行性疾病的药物中的应 用， 其中神经退行性疾病包括例如老年痴呆、 帕金森等疾病。 3. 一种用于防治心脑血管疾病和神经退行性疾病的药物组合物， 所述药物组合物由七 叶胆苷 与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂制备而成。 4. 根据权利要求 3 所述的药物组合物， 其中还可以含有一种或多种其他用于同类疾病 的活性成分。 5. 根据权利要求 3 或 4 所述的药物组合

4、物， 其最小剂量单元所含活性成分七叶胆苷 的量为 2.5-100mg。 6. 根据权利要求 5 所述的药物组合物， 其为临床上任何可接受的任何剂型形式。 7. 根据权利要求 6 所述的药物组合物， 其所述的剂型包括口服及肠胃外给药形式的各 种剂型。 8. 根据权利要求 6 所述的药物组合物， 其所述的剂型用于口服时， 是片剂、 胶囊、 软胶 囊、 口服液、 糖浆、 颗粒、 滴丸、 口崩片、 缓释片、 缓释胶囊、 控释片、 控释胶囊 ； 用于肠胃外给 药途径时， 是水针、 冻干粉针、 无菌粉针、 输液。 9. 根据权利要求 6 所述的药物组合物， 其所述的剂型为片剂和水针剂型。 10. 根据权利

5、要求 3 所述的药物组合物， 其中所述药学上可接受的载体或赋形剂选自 适用于口服制剂的药用赋形剂 ： 填充剂、 粘合剂、 润滑剂、 崩解剂、 助溶剂、 表面活性剂、 吸附 载体 ； 或选自适用于注射剂的药用赋形剂 ： 溶剂、 抗氧剂、 助溶剂、 吸附剂、 渗透压调节剂、 pH 调节剂。 权 利 要 求 书 CN 103933052 A 2 1/11 页 3 七叶胆苷在制备用于防治心脑血管及神经退行性疾病 药物中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种药用活性成分在制备药物中的应用， 尤其涉及七叶胆苷 在 制备药物中的应用， 属医药技术领域。 背景技术 0002 三七是我国名贵药材， 其主要活

6、性成分为达玛烷型四环三萜皂苷， 近年来， 关于 三七活性成分和药理作用的研究逐渐增多， 但三七中活性成分种类繁多， 仅三七茎叶中 分离得到的皂苷成分就多达 20 种以上， 迫切需要对其中各个皂苷单体进行系统的药理 学研究和开发其医药用途。七叶胆苷 ， 结构如式 1 所示， 其分子式为 C48H82O18。七叶 胆苷 为天然皂苷类化合物， 广泛存在于三七 Panax Notoginseng， 绞股蓝 Fiveleaf Gynostemma Herb 的根茎中。七叶胆苷 具有很强的抗氧化能力， 可作为抗氧化剂添加 到食品、 药品以及化妆品中。七叶胆苷 在防治脑血管及神经退行性疾病方面未见报 道。研

7、究开发七叶胆苷 的其他用途可以充分发挥七叶胆苷 的使用潜力， 提高其 效用。 0003 发明内容 0004 本发明人发现， 七叶胆苷 在防治心脑血管疾病如脑缺血性疾病、 脑缺血再灌 注损伤、 氧化应激性脑损伤等疾病中有很好的效果。 0005 本发明人还发现， 七叶胆苷 在防治神经退行性疾病如老年痴呆、 帕金森等疾 病中有很好的效果。 0006 本发明所要解决的技术问题是提供七叶胆苷 在制备用于防治心脑血管疾病 的药物中的应用。 所述心脑血管疾病包括脑缺血性疾病、 脑缺血再灌注损伤、 氧化应激性脑 说 明 书 CN 103933052 A 3 2/11 页 4 损伤等。本文所称的七叶胆苷 均包括

8、其药学上可接受的盐。 0007 本发明所要解决的另一技术问题是提供七叶胆苷 在制备用于治疗神经退行 性疾病的药物中的应用， 所述神经退行性疾病包括老年痴呆、 帕金森等。 0008 本发明同时提供了用于防治心脑血管疾病和神经退行性疾病的药物组合物， 所述 药物组合物由七叶胆苷 与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂制备而成。本发 明的药物组合物中还可以含有一种或多种其他用于同类疾病的活性成分。 0009 本发明所述的防治心脑血管疾病和神经退行性疾病的药物组合物， 最小剂量单元 所含活性成分七叶胆苷 的量为 2.5-100mg。 0010 本发明提供的药物组合物可为临床上任何可接受的剂型形式。 包

9、括口服及肠胃外 给药形式的各种剂型。用于口服时， 可以是片剂、 胶囊、 软胶囊、 口服液、 糖浆、 颗粒、 滴丸、 口崩片、 缓释片、 缓释胶囊、 控释片、 控释胶囊 ； 用于肠胃外给药途径时， 可以是水针、 冻干粉 针、 无菌粉针、 输液。本发明药物组合物优选片剂和水针剂型。 0011 所述药学上可接受的载体或赋形剂可选自适用于口服制剂的药用赋形剂， 包括填 充剂、 粘合剂、 润滑剂、 崩解剂、 助溶剂、 表面活性剂、 吸附载体等。 0012 所述药学上可接受的载体或赋形剂可选自适用于注射剂的药用赋形剂， 包括溶 剂、 抗氧剂、 助溶剂、 吸附剂、 渗透压调节剂、 pH 调节剂。 0013

10、药物组合物最小剂量单元是指一片， 一颗胶囊， 一袋颗粒或一支注射剂等。 0014 本发明的药物剂型可使用药物制剂领域常规的方法生产， 没有特别限制。 例如， 本 发明片剂可通过使用本领域公知的合适的方法粒化、 干燥和筛分主要药剂和赋形剂、 粘合 剂等等， 向所得混合物中加入润滑剂等等然后混合并形成片剂。造粒可通过本领域公知的 任何合适的方法进行， 例如湿法造粒、 干法造粒或加热造粒。 合适的非限制性实例包括使用 高速搅拌造粒机、 流动造粒干燥机、 挤压造粒机或滚筒压紧器进行这些造粒方法。此外， 例 如干燥和筛分的方法可以根据进行造粒的需要进行。主要药剂、 赋形剂、 粘合剂、 润滑剂等 等的混合

11、物还可直接形成片剂。 0015 如果需要薄膜包衣， 可以使用本领域已知的任何薄膜包衣装置， 并且作为薄膜包 衣基质， 合适的实例包括糖衣基、 亲水膜包衣基、 肠溶薄膜包衣基和缓释薄膜包衣基。 附图说明 0016 图 1 七叶胆苷 对缺血再灌注造成的脑梗死面积的影响。 0017 图 2 七叶胆苷 对缺血再灌注造成的神经细胞凋亡的影响。 0018 图 3 七叶胆苷 对 H2O2造成的 PC12 细胞凋亡的影响。 0019 图 4 七叶胆苷 对 H2O2造成的 PC12 细胞细胞线粒体膜电位 （ m） 下降的影 响。 0020 图 5 七叶胆苷 对 APP/PS1 转基因的 AD 动物模型的逃避潜伏

12、期的影响。 具体实施方式 0021 下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明。 0022 实施例 1 ： 七叶胆苷 对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。 0023 1 材料 说 明 书 CN 103933052 A 4 3/11 页 5 0024 七叶胆苷 由中国医学科学院药用植物研究所化学室提供 ； 0025 SD 大鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。 0026 2 方法 0027 2.1 实验动物和药物 0028 本实验方案是依据中国实验动物应用指南进行的。本实验采用体重为 250300g 的 SD 大鼠， 饲养房间的温度为 221， 湿度为 60%。实验前先使大鼠在 12h 昼

13、夜节律交替 中适应环境 7 天。大鼠随机分为四组， 正常组， 模型组， 七叶胆苷 组。正常组只分离颈 动脉， 不栓塞。七叶胆苷 组在大脑中动脉栓塞手术前 72,48, 和 24h 腹腔注射七叶胆 苷 (5mg/kg), 而模型组在大脑中动脉栓塞手术前 72,48, 和 24h 腹腔注射同样体积的 生理盐水。七叶胆苷 用生理盐水新鲜配制。 0029 2.3 大脑中动脉栓塞手术 0030 大脑中动脉栓塞手术是参照 Longa 在 1989 报道的文献方法进行的。大鼠用 10% 的水合氯 300mg/kg 腹腔注射麻醉后， 分离右颈总动脉， 颈外动脉和颈内动脉。然后用 4A 级 鱼线插入颈内动脉以阻

14、断大脑中动脉 1.5h， 抽出鱼线进行再 灌注， 再灌注时间为 24h， 大 鼠直肠温度在整个实验过程中维持在 37 0.5。 0031 2.4 神经功能评价 0032 大鼠缺血再灌注 24h 后， 采用 Bederson 评分方法进行神经功能评价 ： 0， 神经功能 没有受损 ;1, 前肢功能轻微减弱 ;2, 前肢功能严重减弱 , 提起大鼠尾巴后， 大鼠不停的扭 向受损区 ;3, 不停的转圈 ;4, 走路困难， 意识模糊 ;5, 死亡。 0033 2.5 脑梗塞面积测量 0034 此实验用 TTC 染色法测定脑梗塞面积。大鼠缺血再灌注 24h 后， 麻醉处死后迅速 取脑， 并将鼠脑切成连续的

15、厚度为2mm的切片， 然后将切片浸在1%TTC中37孵育30分钟， 再进行拍照。脑梗塞面积用 Image-Pro plus5.0 软件进行测量计算。 0035 2.6 形态学观察 0036 大鼠用 4% 的多聚甲醛固定后取脑， 做成石蜡切片， 再用 HE 进行染色， 光学显微镜 进行形态学观察。 0037 2.7. 原位细胞凋亡检测 0038 此实验用 TUNEL 法检测脑组织的细胞凋亡。将脑组织做成石蜡切片， 切片经过脱 蜡和脱水后 , 用 Proteinase K 孵育 15 分钟， 接着用 3%H2O2 孵育 10 分钟， 接着 TdT 工作液 孵育， 再用终止液终止反应， 最后用抗地高

16、辛过氧化物酶进行显色并用荧光显微镜进行观 察拍照。 0039 2.8 免疫组化 0040 此实验用免疫组化法检测脑组织中 Bcl-xl,Bax 和 Caspase-3 的表达情况。将大 鼠麻醉后， 用 4% 的多聚甲醛进行固定， 迅速取脑， 把鼠脑做成石蜡切片。切片先用兔抗鼠 Bcl-xl,Bax 和 caspase-3 抗体 (1:500） 4孵育过夜 , 再用羊抗兔抗体 (1:500） 室温孵育 1h, 接着用 0.5g/L DAB 孵育 5min。 0041 3 结果 0042 3.1 七叶胆苷 能够减少缺血再灌注导致的神经功能损伤。 0043 神经功能评价 说 明 书 CN 10393

17、3052 A 5 4/11 页 6 0044 表 1-1 ： 七叶胆苷 对阻断大脑中动脉所致的局灶性脑缺血大鼠行为状态的 影响 （XS） 0045 0046 注 ： 与正常组比较 #P 0.05， #P 0.01 ； - 0047 与模型组比较 *P 0.05， *P 0.01 0048 脑梗塞面积分析， 如图 1 所示 0049 表 1-2 ： 七叶胆苷 对阻断大脑中动脉所致的脑梗塞面积的影响 （XS） 0050 0051 注 ： 与正常组比较 #P 0.05， #P 0.01 ； - 0052 与模型组比较 *P 0.05， *P 0.01 0053 3.2 七叶胆苷能够减轻缺血再灌注引起

18、的神经细胞形态学变化和减少神经 细胞凋亡， 如图 2 所示。 0054 实施例 2 ： 七叶胆苷 对氧化应激诱导神经细胞损伤的保护作用。 0055 1、 材料 0056 七叶胆苷 由中国医学科学院药用植物研究所化学室提供。 0057 DMEM, 胎牛血清和马血清购自 Gibco 公司。 0058 PC12 细胞株购自中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所。 0059 H2O2 和 DMSO 购自北京化工厂。 0060 维生素 E,TTC,MTT 和 JC-1 购自 Sigma 公司。 0061 考马斯亮兰 ,LDH,MDA,SOD,CAT,GSH-Px,GR 检测试剂盒购自南京建成生物工程

19、研 究所。 0062 TUNEL 试剂盒购自 Roche 公司。 0063 Annexin V/PI 检测试剂盒购自 Invitrogen 公司。 说 明 书 CN 103933052 A 6 5/11 页 7 0064 Caspase-3 荧光检测试剂盒购自 BioVision 公司。 0065 -actin,Bcl-xl,Bax,ERK1/2,p-ERK1/2,Akt,p-Akt,Nrf2, 和 HO-1 等抗体购自 Santa Cruz 公司。 0066 LY294002 和 U0126 购自 Calbiochem 公司。 0067 2、 方法 0068 2.1. 细胞培养 0069 P

20、C12 细胞培养液为含 10% 胎牛血清， 5% 马血清， 100U/ml 青霉素和 100g/ml 链 霉素的 DMEM 完全培养基。PC12 细胞置于 37， 5%CO2 和 95% 的空气的培养箱中进行培养。 此实验所用的 PC12 细胞均处于对数生长期。 0070 2.2. 细胞活力检测和形态学观察 0071 此实验用 MTT 法检测细胞活力。PC12 细胞 (2104/ml) 种植于 96 孔板中， 继续培 养 24h。PC12 细胞用七叶胆苷 (100g/ml) 预孵育 24h 后， 再用 100MH2O2 处理 6h， 加入 MTT 溶液 (5mg/ml)， 37孵育 4h， 用

21、 DMSO 溶解结晶物， 振摇 10 分钟， 酶标仪 570nm 处 测定吸收值。使用倒置显微镜观察 PC12 细胞经 H2O2 处理后的形态学变化。 0072 2.3.TUNEL 法检测细胞凋亡 0073 PC12 细胞种植于细胞爬片上， 继续培养 24h， 经 H2O2 处理后， 先用 10% 多聚甲醛 室温固定 30 分钟， 再与含 0.3%H2O2 的甲醇溶液孵育 30min， 使内源性过氧化物酶失活。然 后再与含 0.1% 柠檬酸盐和 0.1%Triton X-100 溶液 4孵育 2 分钟。最后与 TUNEL 反应液 37孵育 60 分钟， 用荧光显微镜观察并拍照。2.4. 流式细

22、胞术检测细胞凋亡 0074 此次实验使用 Annexin V/PI 染色法流式细胞仪检测细胞凋亡率。PC12 细胞经 100M H2O2处理后,收集细胞并用预冷PBS洗两次， 加入500l的1Annexin V溶液和 1l 的 PI( 终浓度为 1g/ml)， 混匀后室温放置 15 分钟。再使用流式细胞仪进行检测分 析细胞凋亡率。 0075 2.5. 检测线粒体膜电位 (MMP) 0076 此次实验用 JC-1 染料检测线粒体膜电位的变化。收集 PC12 细胞， 先用 2M 的 JC-1溶液37避光孵育30分钟,然后用PBS洗两遍， 再使用流式细胞仪检测被 JC-1染色 的 PC12 细胞，

23、或者使用荧光显微镜观察被 JC-1 染色的 PC12 细胞。 0077 2.6. 检测 Caspase-3 活化 0078 此次实验用caspase-3荧光染色试剂盒检测Caspase-3活化。 PC12细胞(1106/ ml) 经 50l 预冷的裂解液裂解后， 置于冰上 10 分钟， 再加入 50l2 反应液 ( 含 10mM DTT) 和 5l 的 1mM DEVD-AFC 底物 ,37孵育 2 小时， 使用酶标仪检测荧光值， 激发波长为 400nm， 发射波长为 505nm。 0079 2.7. 检测 LDH 渗漏 ,MDA 水平和 SOD,CAT,GSH-Px 活力 0080 PC12

24、 细胞经 100M H2O2 处理 6h 后， 收集 PC12 细胞培养液， 以备检测 LDH 渗漏。 收集细胞， 匀浆， 4， 3000rpm 离心 10 分钟取上清， 以备检测 MDA 水平和 SOD， CAT， GSH-Px 活力。使用考马斯亮兰试剂盒测定蛋白浓度。 0081 2.8. 检测 ROS 生成 0082 此次实验用 ROS 检测试剂盒检测 ROS 生成。PC12 细胞经 H2O2 处理后， 收集细胞， 用 1 洗液洗一遍， 再用 100l 的 carboxy-H2DCFDA( 终浓度 25M) 溶液 37避光孵育 说 明 书 CN 103933052 A 7 6/11 页 8

25、 30 分钟， 用酶标仪检测荧光值， 激发波长为 495nm， 发射波长为 529nm。 0083 2.9. 蛋白表达检测 0084 此次实验用 Western blot 法检测 PC12 细胞内蛋白表达情况。收集 PC12 细胞， 用 PBS 洗一次 , 再用含 1%PMSF 的细胞裂解液裂解细胞， 4， 12000rpm 离心 5 分钟收集上清， 用 BCA 试剂盒定量蛋白浓度。吸取含 10g 蛋白的裂解物用 10%SDS-PAGE 分离并转至硝酸 纤维素膜上， 再用5%脱脂奶粉封闭40分钟， 一抗4孵育过夜， 用TBST洗三遍， 再用二抗室 温孵育 1 小时， 用 TBST 洗三遍， 再

26、用 eECL 试剂盒进行显色。 0085 2.10. 统计方法 0086 实验结果使用平均值 标准差的方式表示， 使用 SPSS17.0 软件进行统计分析 .T 检测结果为 P0.05 的算做显著性差异。 0087 3. 结果 0088 3.1 七 叶 胆 苷 (12.5,25,50g/ml) 对 PC12 细 胞 预 处 理 24 小 时 后 H2O2(100M) 损伤的保护作用， 如表 2-1,2-2 所示。 0089 表 2-1 七叶胆苷 预孵育 24h 对 PC12 细胞活性的影响 0090 0091 0092 注 ： 与正常组比较 #P 0.05， #P 0.01 ； - 0093

27、与模型组比较 *P 0.05， *P 0.01 0094 表 2-2 七叶胆苷预孵育 24h 对 H2O2(100M) 诱导 PC12 细胞损伤的影响 0095 0096 注 ： 与正常组比较 #P 0.05， #P 0.01 ； - 0097 与模型组比较 *P 0.05， *P 0.01 0098 3.2 七叶胆苷 能够抑制 H2O2 诱导 PC12 细胞凋亡， 如图 3 所示。 0099 3.3 七叶胆苷抑制 H2O2 诱导 PC12 细胞线粒体膜电位的下降， 如图 4 所示。 0100 3.4 七叶胆苷能够抑制 H2O2 诱导 PC12 细胞 MDA 的产生， 增强 SOD， CAT

28、和 GSH-Px 活力， 如表 2-3,2-4,2-5 所示。 0101 表 2-3 七叶胆苷对 H2O2诱导 PC12 细胞氧化应激的影响 说 明 书 CN 103933052 A 8 7/11 页 9 0102 0103 注 ： 与正常组比较 #P 0.05， #P 0.01 ； - 0104 与模型组比较 *P 0.05， *P 0.01 0105 表 2-4 七叶胆苷对 H2O2诱导 PC12 细胞氧化应激的影响 0106 0107 0108 注 ： 与正常组比较 #P 0.05， #P 0.01 ； - 0109 与模型组比较 *P 0.05， *P 0.01 0110 表 6 七叶

29、胆苷对 H2O2诱导 PC12 细胞氧化应激的影响 0111 0112 注 ： 与正常组比较 #P 0.05， #P 0.01 ； - 0113 与模型组比较 *P 0.05， *P 0.01 0114 实施例 3 ： 七叶胆苷 对缺氧复氧造成的原代培养神经元细胞损伤的保护作 用。 0115 材料与方法 说 明 书 CN 103933052 A 9 8/11 页 10 0116 1. 材料 0117 SD 大鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。 0118 七叶胆苷 由中国医学科学院药用植物研究所化学室提供。 0119 DMEM/F12, 胎牛血清， B27， neurobasal A 培

30、养液购自 Gibco 公司。 0120 MTT 购自 Sigma 公司。 0121 DMSO 购自北京化工厂。 0122 2. 方法 0123 本实验方案是依据中国实验动物应用指南进行的。原代神经元细胞取自 18 天胎 鼠， 分离胎鼠大脑皮层， 剪碎， 用 0.125% 的胰酶 37消化 10min， 200 目筛网过滤， 收集滤液 至离心管， 1000rpm 离心 5min, 弃上清液， 加入 15ml 含 20% 胎牛血清的 DMEM/F12 重悬细 胞， 转入 75cm2培养瓶中， 培养箱差速贴壁 1h。1h 后翻转培养瓶， 倒出液体至新的离心管， 1000rpm 离心 5min， 弃上

31、清液， 加 5ml 含 20% 胎牛血清的 DMEM/F12 重悬细胞， 计数， 调整细 胞数为 1x106 个 /ml， 种植于 0.1mg ml-1的左旋多聚赖氨酸包被的 96 孔板中， 4h 换成含 2% 的 B27 无血清 neurobasal A 培养液， 以 后隔天半量换液。以原代培养为第 1 天， 正常培养 第 7 天用于实验。缺氧 6h， 复氧 24h， MTT 法检测细胞活力。 0124 结果 0125 表 3-1 ： 七叶胆苷 对缺氧复氧造成的原代培养神经元细胞损伤的保护作用。 0126 0127 注 ： 与正常组比较 #P 0.05， #P 0.01 ； - 0128 与

32、模型组比较 *P 0.05， *P 0.01 0129 实施例 4 ： 七叶胆苷 对 A 诱导神经细胞损伤的保护作用。 0130 材料与方法 0131 1. 材料 0132 SD 大鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。 0133 七叶胆苷 由中国医学科学院药用植物研究所化学室提供。 0134 DMEM/F12, 胎牛血清， B27， neurobasal A 培养液购自 Gibco 公司。 0135 MTT,A 购自 Sigma 公司。 0136 DMSO 购自北京化工厂。 0137 2. 方法 0138 本实验方案是依据中国实验动物应用指南进行的。原代神经元细胞取自 18 天胎 鼠，

33、分离胎鼠大脑皮层， 剪碎， 用 0.125% 的胰酶 37消化 10min， 200 目筛网过滤， 收集滤液 至离心管， 1000rpm 离心 5min, 弃上清液， 加入 15ml 含 20% 胎牛血清的 DMEM/F12 重悬细 说 明 书 CN 103933052 A 10 9/11 页 11 胞， 转入 75cm2 培养瓶中， 培养箱差速贴壁 1h。1h 后翻转培养瓶， 倒出液体至新的离心管， 1000rpm 离心 5min， 弃上清液， 加 5ml 含 20% 胎牛血清的 DMEM/F12 重悬细胞， 计数， 调整细 胞数为 1x106 个 /ml， 种植于 0.1mgml-1 的左

34、旋多聚赖氨酸包被的 96 孔板中， 4h 换成含 2% 的 B27 无血清 neurobasal A 培养液， 以后隔天半量换液。以原代培养为第 1 天， 正常培 养第 7 天用于实验。 0139 12.5,25,50g/ml的七叶胆苷预孵育原代神经元24h， 50M的A处理原代 神经元 24h， MTT 法检测细胞活力。 0140 3. 结果 0141 表 4-1 ： 七叶胆苷 对 A诱导神经细胞损伤的保护作用 0142 0143 注 ： 与正常组比较 #P 0.05， #P 0.01 ； - 0144 与模型组比较 *P 0.05， *P 0.01 0145 实施例 5 ： 七叶胆苷 对

35、APP/PS1 转基因的 AD 动物模型的保护作用。 0146 材料与方法 0147 1. 材料 0148 APP/PS1 转基因的 AD 大鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。 0149 七叶胆苷 由中国医学科学院药用植物研究所化学室提供。 0150 2. 方法 0151 分组 ： 正常组， APP/PS1 转基因的 AD 大鼠模型组， 20mg/kg 七叶胆苷 组 ,40mg/kg 七叶胆苷 组。七叶胆苷 口服给药 30 天后， 水迷宫检测穿梭平台次 数， 目标象限滞留时间等学习记忆能力。 0152 3. 结果 0153 表 5-1 ： 七叶胆苷 对 APP/PS1 转基因的 AD

36、动物模型的穿梭平台次数的影响 0154 0155 注 ： 与正常组比较 #P 0.05， #P 0.01 ； 0156 与模型组比较 *P 0.05， *P 0.01 说 明 书 CN 103933052 A 11 10/11 页 12 0157 表 :5-2 七叶胆苷 对 APP/PS1 转基因的 AD 动物模型的保护作用 0158 0159 0160 注 ： 与正常组比较 #P 0.05， #P 0.01 ； - 0161 与模型组比较 *P 0.05， *P 0.01 0162 实施例 6 ： 七叶胆苷对 6-OHDA 诱导 PC12 细胞损伤的 PD 细胞模型的保护作用 0163 材料

37、与方法 0164 1. 材料 0165 七叶胆苷 由中国医学科学院药用植物研究所化学室提供。 0166 PC12 细胞购自北京协和医学院基础医学研究所。 0167 DMEM, 胎牛血清， 马血清购自 Gibco 公司。 0168 MTT,6-OHDA 购自 Sigma 公司。 0169 DMSO 购自北京化工厂。 0170 2. 方法 0171 分组 ： 正常组， 6-OHDA 模型组， 12.5g/ml 七叶胆苷 组 ,25g/ml 七叶胆苷 组,50g/ml七叶胆苷 组。 七叶胆苷 预孵育PC12细胞24h， 100M6-OHDA 处理 PC12 细胞 24h， MTT 检测细胞活力。 0

38、172 3. 结果 0173 表 6-1 ： 七叶胆苷 对 6-OHDA 诱导 PC12 细胞损伤的 PD 细胞模型的保护作用 0174 0175 注 ： 与正常组比较 #P 0.05， #P 0.01 ； - 0176 与模型组比较 *P 0.05， *P 0.01 0177 实施例 7 ： 七叶胆苷 对纹状体注射 6-OHDA 的 PD 动物模型的保护作用 0178 材料与方法 0179 1. 材料 0180 SD 大鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。 0181 七叶胆苷 由中国医学科学院药用植物研究所化学室提供。 说 明 书 CN 103933052 A 12 11/11 页 1

39、3 0182 2. 方法 0183 本实验方案是依据中国实验动物应用指南进行的。本实验采用体重为 250300g 的 SD 大鼠， 饲养房间的温度为 221， 湿度为 60%。实验前先使大鼠在 12h 昼夜节律交替 中适应环境 7 天。大鼠随机分为四组， 正常组， 模型组， 七叶胆苷 (20mg/kg) 组和七叶 胆苷 (40mg/kg)组。 大鼠用10%的水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉后， 用脑定位仪选 择纹状体 （AP:-4.4mm,L1.2mm,V7.8mm） ， 用牙科钻在 Wister 鼠颅骨打孔， 正常组注射 1l 生理盐水， 模型组， 七叶胆苷 组注射 1l， 100M 的

40、 6-OHDA 溶液， 缝合伤口。 0184 3. 结果 0185 表 7 七叶胆苷 对纹状体注射 6-OHDA 的 PD 动物模型的行为状态的影响 (XS) 0186 0187 注 ： 与正常组比较 #P 0.05， #P 0.01 ； 0188 与模型组比较 *P 0.05， *P 0.01 0189 显然， 本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例， 而并非是对 本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说， 在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些 属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。 说 明 书 CN 103933052 A 13 1/4 页 14 图 1 说 明 书 附 图 CN 103933052 A 14 2/4 页 15 图 2 说 明 书 附 图 CN 103933052 A 15 3/4 页 16 图 3 说 明 书 附 图 CN 103933052 A 16 4/4 页 17 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103933052 A 17