植物调控元件及其应用.pdf

1、10申请公布号CN102016049A43申请公布日20110413CN102016049ACN102016049A21申请号200980114911422申请日2009033061/042,95720080407USC12N15/82200601A01H5/0020060171申请人孟山都技术公司地址美国密苏里州72发明人S弗拉辛斯基CR迪特里希74专利代理机构北京市金杜律师事务所11256代理人陈文平54发明名称植物调控元件及其应用57摘要本发明提供用于植物中的新型调控元件。本发明还提供含有这些新型调控元件的DNA构建体；含有这些新型调控元件的转基因细胞、植物和种子；以及制备和使用它们的方

2、法。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2010102686PCT申请的申请数据PCT/US2009/0388122009033087PCT申请的公布数据WO2009/126470EN2009101551INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书20页序列表13页附图3页CN102016059A1/1页21一种包含调控元件的DNA分子，该调控元件具有选自以下的DNA序列A与选自SEQIDNO120的DNA序列具有至少85序列一致性的序列，B选自SEQIDNO120的序列，以及C具有启动子活性的SEQIDNO120中任意序列的片段，其中所述调控元件可操作

3、地连接至异源可转录的多核苷酸分子。2如权利要求1所述的DNA分子，其中，所述序列与选自SEQIDNO120的DNA序列具有至少90的序列一致性。3如权利要求1所述的DNA分子，其中，所述序列与选自SEQIDNO120的DNA序列具有至少95的序列一致性。4一种包含调控元件的DNA构建体，该调控元件具有选自以下的DNA序列A与选自SEQIDNO120的DNA序列具有至少85序列一致性的序列，B选自SEQIDNO120的序列，以及C具有启动子活性的SEQIDNO120中任意序列的片段，其中所述调控元件可操作地连接至异源可转录的多核苷酸分子。5如权利要求4所述的DNA构建体，其中，所述可转录的多核苷

4、酸分子为农学目的基因。6如权利要求4所述的DNA构建体，其中，所述可转录的多核苷酸分子为在植物中能够提供除草剂抗性的基因。7如权利要求4所述的DNA构建体，其中，所述可转录的多核苷酸分子为在植物中能够提供植物害虫控制的基因。8一种稳定地转化有权利要求1所述的DNA分子的转基因植物细胞。9如权利要求8所述的转基因植物细胞，其中，所述转基因植物细胞为单子叶植物细胞。10一种稳定地转化有权利要求1所述的DNA分子的转基因植物。11一种如权利要求10所述的转基因植物的植物部分，其中，所述植物部分包含所述DNA分子。12一种如权利要求10所述的转基因植物的种子，其中，所述种子包含所述DNA分子。权利要求

5、书CN102016049ACN102016059A1/20页3植物调控元件及其应用0001本申请要求于2008年4月7日提交的美国临时申请第61/042,957号的优先权，其全部内容通过引用方式结合在本文中。0002序列表引入0003包含于文件名为“MONS222WO_SEQUENCE_LISTING”的文件中的序列表其按MICROSOFTWINDOWS测定为302千字节，并且于2009年3月30日创建，在此通过电子方式提交并且以引用方式结合在本文中。技术领域0004本发明涉及植物分子生物学和植物遗传工程和用于调节植物中基因表达的DNA分子的领域。背景技术0005调控元件为通过调节可操作地连接

6、的可转录的多核苷酸分子的转录、以调控基因活性的遗传元件。这样的元件包括启动子、前导序列、内含子和3非翻译区，并且可用于植物分子生物学和植物遗传工程领域。发明内容0006本发明提供用于植物中的来自小米FOXTAILMILLET小米SETARIAITALICALBEAUV的新型调控元件。本发明还提供含有调控元件的DNA构建体。本发明还提供包含可操作地连接至可转录的多核苷酸分子的调控元件的转基因植物细胞、植物和种子。本发明还提供制备和使用调控元件、包含调控元件的DNA构建体和包含可操作地连接至可转录的多核苷酸分子的调控元件的转基因植物细胞、植物和种子的方法。0007附图简述0008图1表示根据来自脂

7、质转移蛋白基因的调控元件设计的三个启动子变体。SEQIDNO15为PSETITRCC3111，长度为2062个核苷酸碱基对；SEQIDNO20为PSETITRCC31111，长度为915个核苷酸碱基对；以及SEQIDNO18为PSETITRCC31110，长度为1563核苷酸碱基对。0009图2表示根据来自类金属硫蛋白基因的调控元件设计的两个启动子变体。SEQIDNO5为PSETITMTHA111，长度为483个碱基对；SEQIDNO8为PSETITMTHB112，长度为1516个碱基对。0010图3A和3B共同表示通过使用CLUSTALW182多序列比对来自脱水相关蛋白基因的启动子的两个等位

8、基因变体，得到的序列比对。在比对序列下的共有序列中，将匹配标记为“”，将错配标记为“”，以及将缺失/插入标记为“”。当比对时，两个等位基因变体具有相同的前导序列，但是启动子序列为序列变体。SEQIDNO10为PSETITDRPA111，SEQIDNO13为PSETITDRPB111。说明书CN102016049ACN102016059A2/20页4具体实施方式0011提供了以下定义和方法以更好地限定本发明并且指导本领域普通技术人员实施本发明。除非特殊说明，根据相关领域普通技术人员的常规用法来理解这些术语。0012DNA分子0013如本文所使用的，术语“DNA”或“DNA分子”是指基因组双链DN

9、A分子或合成的双链DNA分子，即脱氧核苷酸碱基的聚合物或多核苷酸分子，从5上游端至3下游端读取。如本文所使用的，术语“DNA序列”是指DNA分子的核苷酸序列。本文中所使用的命名按美国联邦法规UNITEDSTATESCODEOFFEDERALREGULATIONS1822第37款所规定的，并且在WIPO标准ST251998，附录2，表1和3的表格中有所阐述。0014如本文所使用的，术语“分离的DNA分子”是指与其自然或天然状态存在时通常与其相伴的其他分子至少部分分离的DNA分子。在一个实施方式中，术语“分离的”是指与其自然或天然状态存在时通常与其侧翼相接的核酸至少部分分离的DNA分子。因此，融合

10、至通常与它们不相关的调控或编码序列的DNA分子例如作为重组技术的结果，在本文中被认为是分离的。即使被整合至宿主细胞的染色体中或者与其他DNA分子存在于核酸溶液中，这样的分子也被认为是分离的。0015本领域内技术人员公知的任何方法均可用于分离和操作本发明公开的DNA分子或其片段。例如，PCR聚合酶链反应技术可用于扩增特定的起始DNA分子和/或产生原始分子的变体。DNA分子或其片段也可通过其他技术例如用化学手段直接合成片段，正如通常使用自动化寡核苷酸合成仪进行的获得。0016如本文所使用的，术语“序列一致性”是指两个优化比对的多核苷酸序列为一致的程度。优化的序列比对是通过手动比对两个序列例如，参考

11、序列和另一序列产生的，以最大化在序列比对中具有适合的内部核苷酸的插入、缺失或间隙的核苷酸匹配的数目。如本文所使用的，术语“参考序列”是指SEQIDNO120所示的序列。0017如本文所使用的，术语“百分比序列一致性”或“百分比一致性”或“一致性”为一致性分数乘以100。同参考序列优化比对的序列的“一致性分数”为在优化的比对中核苷酸匹配除以参考序列中的核苷酸总数例如整个参考序列总长度的核苷酸总数。因此，本发明的一个实施方式为当与参考序列在此为SEQIDNO120优化比对时，包含与参考序列具有约85或更高的一致性、约90或更高的一致性、约95或更高的一致性，或至少96的一致性、97的一致性、98的

12、一致性，或99的一致性并且具有基因调控活性的序列的DNA分子。0018调控元件0019调控元件为具有基因调控活性的DNA分子，即具有影响可操作地连接的可转录的多核苷酸分子的转录和/或翻译的能力的DNA分子。因此术语“基因调控活性”是指通过影响可操作地连接的可转录的多核苷酸分子的转录和/或翻译而影响可操作地连接的可转录的多核苷酸分子的表达模式的能力。基因调控活性可以为正向和/或负向，并且该影响可通过其时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应特性以及定量或定性指标进行表征。0020例如启动子、前导序列、内含子和转录终止区域的调控元件为具有基因调控活性以及对活体细胞的基因整体

13、表达起重要作用的DNA分子。术语“调控元件”是指具说明书CN102016049ACN102016059A3/20页5有基因调控活性的DNA分子，即具有影响可操作地连接的可转录的多核苷酸分子的转录和/或翻译的能力的DNA分子。因此，在植物中起作用的例如启动子和前导序列的分离的调控元件可用于通过遗传工程方法修饰植物表型。0021调控元件可通过它们的表达模式进行表征，即作为构成性的和/或通过它们的时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应表达模式以及其任意组合，和定量或定性指标进行表征。启动子被用作调节可操作地连接的可转录的多核苷酸分子的表达的调控元件。0022如本文所使用的，

14、“基因表达模式”为将可操作地连接的DNA分子转录为转录的RNA分子的任何模式。表达可通过其时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应特性以及定量或定性指标进行表征。转录的RNA分子可被翻译以产生蛋白质分子或可提供反义或其他调控RNA分子，例如DSRNA、TRNA、RRNA、MIRNA等。0023如本文所使用的，术语“蛋白质表达”为将转录的RNA分子翻译为蛋白质分子的任何模式。蛋白质表达可通过其时间、空间、发育或形态学特性以及定量或定性指标进行表征。0024如本文所使用的，术语“启动子”通常是指参与识别和结合RNA聚合酶II和其他蛋白质反式作用TRANSACTING转录因子

15、以启动转录的DNA分子。启动子可最初从基因的基因组拷贝的5非翻译区5UTR分离。可选地，启动子可为合成产生的或操控的DNA分子。启动子也可为嵌合的，也就是通过两个或更多个异源DNA分子的融合产生的启动子。可用于本发明的启动子包括SEQIDNO2、5、8、10、13和20或其片段或变体。0025在一个实施方式中，提供了本文公开的启动子序列的片段。启动子片段可具有启动子活性，并且可单独使用，或在例如构建嵌合的启动子中与其他启动子和启动子片段联合使用。在具体的实施方式中，提供了包含具有本文公开的启动子活性的多核苷酸分子的至少约50、95、150、250、500或约750个连续核苷酸的启动子片段。当与

16、参考序列优化比对时，该片段可显示出与参考序列具有至少约85、约90、约95、约98、或约99或更高的一致性。0026也可以分析启动子或启动子片段中已知启动子元件的存在，即例如TATA框和其他已知转录因子结合位点基序的DNA序列特性。本领域技术人员可通过这些已知启动子元件的识别来设计具有与原始启动子有相似表达模式的启动子的变体。0027如本文所使用的，术语“增强子”或“增强子元件”是指顺式作用CISACTING转录调控元件，也就是顺式元件，其提供整体表达模式的一个方面，但是通常不足以单独促使可操作地连接的多核苷酸序列的转录。与启动子不同，增强子元件通常不包括转录起始位点TSS或TATA框。启动子

17、可以天然包含一个或多个影响可操作地连接的多核苷酸序列的转录的增强子元件。分离的增强子元件也可与启动子融合以产生嵌合的启动子顺式元件，其提供基因表达的整体调节的一方面。启动子或启动子片段可包含一个或多个影响可操作地连接的基因的转录的增强子元件。据认为，许多启动子增强子元件结合DNA结合蛋白和/或影响DNA拓扑学，从而产生选择性地允许或限制RNA聚合酶接触DNA模板或在转录起始位点促进双螺旋选择性打开的局部构型。增强子元件可起作说明书CN102016049ACN102016059A4/20页6用以结合调控转录的转录因子。一些增强子元件结合多于一种转录因子，并且转录因子可通过不同的亲和力与多于一个增

18、强子结构域相作用。增强子元件可通过多种技术进行识别，包括缺失分析即从启动子5端或内部缺失一个或多个核苷酸；DNA结合蛋白分析，使用DNASEI足印法、甲基化干扰、电泳迁移率改变测试、通过连接介导PCR的体内基因组足印法和其他常规测试；或通过使用已知顺式元件基序或增强子元件作为靶标序列或靶标基序、使用常规DNA序列比较方法例如BLAST进行DNA序列相似性分析。增强子结构域的精细结构可通过一个或多个核苷酸的诱变或取代或通过其他常规方法进一步研究。增强子元件可通过化学合成获得，或从包括该元件的调控元件中分离获得，并且它们可与另外的含有可用的限制性酶切位点的侧翼核苷酸一起合成以有利后续操作。因此，根

19、据本文公开的用于调节可操作地连接的可转录的多核苷酸分子的表达的方法的增强子元件的设计、构建和使用包含于本发明中。0028如本文所使用的，术语“前导序列”是指从基因的基因组拷贝的5非翻译区5UTR分离、并且通常定义为在转录起始位点TSS以及蛋白编码序列起始位点之间的核苷酸节段的DNA分子。可选地，前导序列可为合成产生的或操控的DNA元件。前导序列可用作5调控元件，以调节可操作地连接的可转录的多核苷酸分子的表达。前导序列分子可与异源启动子或它们的天然启动子共同使用。因此，本发明的启动子分子可以可操作地连接至它们的天然前导序列或可操作地连接至异源前导序列。可用于实现本发明的前导序列包括SEQIDNO

20、3、6、11和16或其片段或变体。0029如本文所使用的，术语“嵌合的”是指通过将第一个DNA分子与第二个DNA分子融合而生成的单个DNA分子，其中第一个或第二个DNA分子通常都不会在该构型、即融合其他的构型中发现。因此，嵌合的DNA分子为新的DNA分子而不是通常在自然界中发现的。如本文所使用的，术语“嵌合的启动子”是指通过对DNA分子进行这样的操作而生成的启动子。嵌合的启动子可以结合两个或多个DNA片段；例子可为启动子与增强子元件的融合。因此，根据本文公开的用于调节可操作地连接的可转录的多核苷酸分子的表达的方法的嵌合的启动子的设计、构建和使用包含于本发明中。0030如本文所使用的，术语“变体

21、”是指与第一个DNA分子组成相似但不相同的第二个DNA分子，而第二个DNA分子仍保持通常的功能，即与第一个DNA分子具有相同或相似的表达模式。变体可为第一个DNA分子的较短或截短形式和/或第一个DNA分子的序列变化形式例如具有不同的限制性酶切位点和/或内部缺失、取代和/或插入的DNA分子。在本发明中，SEQIDNO120所示的多核苷酸序列可用于生成与原始调控元件的多核苷酸序列组成相似但不相同的变体，而它们仍保持通常功能即与原始的调控元件相同或相似的表达模式。本领域中普通技术人员根据说明书的公开内容熟知本发明中这样的变体的生成，其包含在本发明的范围内。0031构建体0032如本文所使用的，术语“

22、构建体”是指衍生自任何来源、能够进行基因组整合或自主复制、包含多核苷酸分子其中一个或多个核苷酸分子已经以功能性操作方式连接，即操作性地连接的的任何重组多核苷酸分子例如质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、噬菌体，或线状或环状单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子。如本文所使用的，术语“载体”是指任何可用于转化目的即将异源DNA引入宿主细胞的重说明书CN102016049ACN102016059A5/20页7组多核苷酸构建体。0033如本文所使用的，术语“可操作地连接”是指第一个分子连接到第二个分子，其中分子如此排列以使第一个分子影响第二个分子的功能。两个分子可以或可以不是单个连续分子的一部分，

23、并且可以或可以不相邻。例如，如果启动子调控细胞中目的可转录的多核苷酸分子的转录，则启动子可操作地连接至可转录的多核苷酸分子。0034本发明的构建体通常为双TI质粒边界BORDERDNA构建体，其具有从根癌土壤杆菌AGROBACTERIUMTUMEFACIENS分离的包含TDNA的TI质粒的右边界RB或AGRTURB和左边界LB或AGRTULB区域，随着根癌土壤杆菌细胞提供的转化分子，允许TDNA整合至植物细胞的基因组中参见，例如，美国专利6,603,061。构建体也可包含可在细菌细胞中提供复制功能和抗生素选择性的质粒骨架DNA节段，例如，大肠杆菌复制起点例如ORI322、广范围宿主复制起点例如

24、ORIV或ORIRI，以及编码TN7氨基糖苷腺苷酰转移酶AMINOGLYCOSIDEADENYLTRANSFERASEAADA从而对壮观霉素或链霉素耐受的可选择标记如SPEC/STRP或者庆大霉素GM，GENT可选择性标记基因的编码区。对于植物的转化，宿主细菌菌株通常为根癌土壤杆菌ABI、C58或LBA4404；然而，植物转化领域技术人员公知的其他菌株也可以在本发明中起作用。0035通过将可转录的多核苷酸分子转录为可翻译和表达为蛋白质产物的功能性MRNA分子的方式，将构建体组装和导入细胞中的方法在本领域是已知的。对于本发明的实施，本领域技术人员熟知制备和使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法，

25、参见，例如，MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL，3RDEDITIONVOLUMES1、2和32000JFSAMBROOK、DWRUSSELL和NIRWIN，COLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS。制备特别适合于植物转化的重组载体的方法包括但不局限于整体记载于美国专利4,971,908、4,940,835、4,769,061和4,757,011中的那些。这些类型的载体也已在科技文献中综述过参见，例如，RODRIGUEZ等人，VECTORSASURVEYOFMOLECULARCLONINGVECTORSANDTHEIRUSES，BUTTERW

26、ORTHS，BOSTON，1988和GLICK等人，METHODSINPLANTMOLECULARBIOLOGYANDBIOTECHNOLOGY，CRCPRESS，BOCARATON，FL1993。用于在高等植物中表达核酸的典型载体是本领域已知的，并且包括衍生自根癌土壤杆菌的肿瘤诱导TI质粒的载体ROGERS等人，METHODSINENZYMOLOGY，1532532771987。用于植物转化的包括PCAMVCN转化控制载体的其他重组载体也已经描述在科技文献中参见，例如，FROMM等人，PROCNATLACADSCIUSA，82582458281985。0036构建体可包含不同的调控元件。任何

27、该调控元件可与其他调控元件联合提供。该组合可被设计或改造以产生所需的调控特性。本发明的构建体可典型地包含至少一个可操作地连接至可转录的多核苷酸分子的调控元件，所述可转录的多核苷酸分子可操作地连接至3转录终止分子。0037本发明的构建体可包括本领域已知的任何启动子或前导序列。例如，本发明的启动子可以可操作地连接至异源5非翻译前导序列例如衍生自热休克蛋白基因的异源5非翻译前导序列参见，例如，美国专利NO5,659,122和5,362,865。可选地，本发明的前导序列可以可操作地连接至例如花椰菜花叶病毒35S转录启动子的异源启动子参见，美国专利NO5,352,605。0038如本文所使用的，术语“内

28、含子”是指可被从基因的基因组拷贝中分离或识说明书CN102016049ACN102016059A6/20页8别、并且通常定义为在翻译前在MRNA的处理过程中剪接出的区域的DNA分子。可选地，内含子可为合成产生的或操控的DNA元件。内含子可包含影响可操作地连接的基因转录的元件增强子元件。内含子可用作调控元件以调节可操作地连接的可转录的多核苷酸分子的表达。DNA构建体可包含内含子，该内含子与可转录的多核苷酸分子序列可以是或者不是异源的。本领域的内含子的例子包括水稻肌动蛋白内含子美国专利NO5,641,876以及玉米HSP70内含子美国专利NO5,859,347。0039如本文所使用的，术语“3转录

29、终止分子”或“3UTR”是指在转录中用于生成MRNA分子3非翻译区3UTR的DNA分子。MRNA分子的3非翻译区可通过特定的切割和3多腺苷酸化即聚A尾产生。3UTR可以可操作地连接至多核苷酸分子并且位于可转录的多核苷酸分子的下游，并且可包括提供多腺苷酸化信号和其他能够影响转录、MRNA加工或基因表达的调控信号的多核苷酸。聚A尾被认为在稳定MRNA和启动翻译中起作用。本领域的3转录终止分子的例子为胭脂碱合成酶3区域参见，FRALEY等人，PROCNATLACADSCIUSA，80480348071983；小麦HSP173区域；豌豆核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶RUBISCO小亚基3区域；棉花E63区域

30、美国专利6,096,950；WO0011200A2公开的3区域；以及薏苡辛COIXIN3UTR美国专利NO6,635,806。0040构建体和载体也可包含表达连接的肽类的转运肽编码序列，该连接的肽用于将蛋白质产物靶向至特别是叶绿体、白色体或其他质体细胞器；线粒体；过氧化物酶体；液泡或细胞外部位。使用叶绿体转运肽的记载，可参见美国专利NO5,188,642和美国专利NO5,728,925。许多叶绿体定位CHLOROPLASTLOCALIZED蛋白质从核基因中表达为前体，并且通过叶绿体转运肽CTP靶向叶绿体。该分离的叶绿体蛋白质的例子包括但不局限于与核酮糖1，5，二磷酸羧化酶的小亚基SSU、铁氧还

31、蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、获光复合物蛋白I和蛋白II、硫氧还蛋白F、烯醇丙酮酸莽草酸磷酸合成酶EPSPS相关的那些以及记载于美国专利NO7,193,133的转运肽类。已在体内和体外证明，通过与异源CTP的蛋白质融合可将非叶绿体蛋白质靶向叶绿体，并且CTP足够将蛋白质靶向叶绿体。适合的叶绿体转运肽例如拟南芥PETUNIAHYBRIDAEPSPSCTPCTP2参见，KLEE等人，MOLGENGENET，2104374421987或矮牵牛PETUNIAHYBRIDAEPSPSCTPCTP4参见，DELLACIOPPA等人，PROCNATLACADSCIUSA，83687368771986的引入已显

32、示在转基因植物中将异源EPSPS蛋白质序列靶向叶绿体参见，美国专利NO5,627,061、5,633,435和5,312,910和EP0218571、EP189707、EP508909和EP924299。0041可转录的多核苷酸分子0042如本文所使用的，术语“可转录的多核苷酸分子”是指任何能够被转录为RNA分子的DNA分子，包括但不局限于具有蛋白质编码序列的那些以及具有用于基因抑制的序列的那些。“转基因”是指与宿主细胞异源的可转录的多核苷酸分子和/或人工掺入宿主细胞基因组的可转录的多核苷酸分子。0043本发明的启动子可以可操作地连接至相对于启动子分子为异源的可转录的多核苷酸分子。如本文所使用

33、的，术语“异源的”是指当该组合通常不存在于自然界时的两个或多个多核苷酸分子的组合。例如，两个分子可衍生自不同种类和/或两个分子可衍说明书CN102016049ACN102016059A7/20页9生自不同基因，比如，来自相同种类的不同基因或来自不同种类的相同基因。因此如果该组合通常不存在于自然界，则启动子相对于可操作地连接的可转录的多核苷酸分子为异源的，即该可转录的多核苷酸分子与该启动子分子的组合不是自然发生的可操作地连接的。0044可转录的多核苷酸分子通常可为表达RNA转录体所需的任何DNA分子。RNA转录体的该表达可导致所得到的MRNA分子的翻译以及蛋白质的表达。可选地，可转录的多核苷酸分

34、子可设计为最终导致特定基因或蛋白质的表达降低。这可通过使用以反义方向定向的可转录的多核苷酸分子来实现。本领域的普通技术人员熟悉该反义技术的使用。简而言之，当反义可转录的多核苷酸分子被转录时，RNA产物在细胞中与互补RNA分子杂交并且隔绝SEQUESTER互补RNA分子。该双螺旋RNA分子不能通过细胞的翻译机制翻译为蛋白质，并且在细胞中降解。可以这种方式反向调控任何基因。0045因此，本发明的一个实施方式为本发明的调控元件例如SEQIDNO120所示的调控元件，其可操作地连接至可转录的多核苷酸分子，从而当将所述构建体引入植物细胞中时以需要的水平或以需要的模式调控可转录的多核苷酸分子的转录。在一个

35、实施方式中，可转录的多核苷酸分子包含基因的蛋白质编码区域，并且启动子影响被翻译和表达为蛋白质产物的RNA分子的转录。在另一个实施方式中，可转录的多核苷酸分子包含基因的反义区域，并且启动子影响反义RNA分子或其他相似抑制性RNA分子的转录以抑制靶标宿主细胞中特定目的RNA分子的表达。0046农学目的基因0047可转录的多核苷酸分子可为农学目的基因。如本文所使用的，术语“农学目的基因”是指当在特定的植物组织、细胞或细胞类型中表达时提供与植物形态学、生理学、生长、发育、产量、产物、营养分布、疾病或害虫抗性和/或环境或化学耐受性相关的所需特征的可转录的多核苷酸分子。农学目的基因包括但不局限于编码产量蛋

36、白、抗压蛋白、发育控制蛋白、发育调控蛋白、组织分化蛋白、分生组织蛋白、环境响应蛋白、衰老蛋白、激素响应蛋白、脱落蛋白ABSCISSIONPROTEIN、来源蛋白、SINK蛋白、花调控蛋白、种子蛋白、除草剂抗性蛋白、疾病抗性蛋白、脂肪酸生物合成酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶、杀虫蛋白或例如靶向抑制特定基因的反义或RNAI分子的任何其他试剂的基因。农学目的的基因产物可在植物中起作用以对植物生理学或代谢起作用，或可作为以植物为食的害虫的食物的杀虫剂起作用。0048在本发明的一个实施方式中，本发明的启动子被引入构建体中，以使启动子可操作地连接至作为农学目的基因的可转录的多核苷酸分子。为了获得农

37、学有益特征，农学目的基因的表达是想要的。有益农学特性可为但不局限于，例如除草剂耐受性、昆虫控制、改良的产量、真菌疾病抗性、病毒抗性、线虫抗性、细菌疾病抗性、植物生长和发育、淀粉生产、改良的油生产、高油生产、改良的脂肪酸含量、高蛋白质生产、果实成熟、提高的动物和人类营养、生物聚合物、环境压力抗性、药用肽类和可分泌肽类、改良的加工特性、改良的消化率、酶生产、味道、固氮、杂交制种、纤维生产和生物燃料生产。本领域已知的农学目的基因的例子包括具有除草剂抗性美国专利NO6,803,501、6,448,476、6,248,876、6,225,114、6,107,549、5,866,775、5,804,425

38、、5,633,435和5,463,175、提高的产量美国专利NOUSRE38,446、6,716,474、说明书CN102016049ACN102016059A8/20页106,663,906、6,476,295、6,441,277、6,423,828、6,399,330、6,372,211、6,235,971、6,222,098和5,716,837、昆虫控制美国专利NO6,809,078、6,713,063、6,686,452、6,657,046、6,645,497、6,642,030、6,639,054、6,620,988、6,593,293、6,555,655、6,538,109、6,5

39、37,756、6,521,442、6,501,009、6,468,523、6,326,351、6,313,378、6,284,949、6,281,016、6,248,536、6,242,241、6,221,649、6,177,615、6,156,573、6,153,814、6,110,464、6,093,695、6,063,756、6,063,597、6,023,013、5,959,091、5,942,664、5,942,658、5,880,275、5,763,245和5,763,241、真菌疾病抗性美国专利NO6,653,280、6,573,361、6,316,407、6,215,048、5

40、,516,671、5,773,696、6,121,436、6,316,407和6,506,962、病毒抗性美国专利NO6,617,496、6,608,241、6,015,940、6,013,864、5,850,023和5,304,730、线虫抗性美国专利NO6,228,992、细菌疾病抗性美国专利NO5,516,671、植物生长和发育美国专利NO6,723,897和6,518,488、淀粉生产美国专利NO6,538,181、6,538,179、6,538,178、5,750,876、6,476,295、改良的油生产美国专利NO6,444,876、6,426,447和6,380,462、高油生产

41、美国专利NO6,495,739、5,608,149、6,483,008和6,476,295、改良的脂肪酸含量美国专利NO6,828,475、6,822,141、6,770,465、6,706,950、6,660,849、6,596,538、6,589,767、6,537,750、6,489,461和6,459,018、高蛋白质生产美国专利NO6,380,466、果实成熟美国专利NO5,512,466、提高的动物和人类营养美国专利NO6,723,837、6,653,530、6,5412,59、5,985,605和6,171,640、生物聚合物美国专利NOUSRE37543、6,228,623和5

42、,958,745和6,946,588、环境压力抗性美国专利NO6,072,103、药用肽类和可分泌肽类美国专利NO6,812,379、6,774,283、6,140,075和6,080,560、改良的加工特性美国专利NO6,476,295、改良的消化率美国专利NO6,531,648、低棉子糖美国专利NO6,166,292、工业酶生产美国专利NO5,543,576、改良的味道美国专利NO6,011,199、固氮美国专利NO5,229,114、杂交制种美国专利NO5,689,041、纤维生产美国专利NO6,576,818、6,271,443、5,981,834和5,869,720和生物燃料生产美国

43、专利NO5,998,700。0049可选地，农学目的基因可以通过编码引起内源基因的基因表达的靶向调节的RNA分子而影响以上所述的植物特征或表型，例如通过反义参见，例如，美国专利5,107,065、抑制性RNA“RNAI”，包括通过MIRNA、SIRNA、反式作用SIRNA和相控SRNA调节机理调节基因表达，例如，如描述于发表的申请US2006/0200878、US2008/0066206和US2009/0070898，或共抑制调节机理。RNA也可以为催化的RNA分子例如，核酶或核开关；参见例如，US2006/0200878，其经工程化用于切割需要的内源性MRNA产物。因此，任何编码影响农学重要

44、表型或目的形态学变化的可转录的RNA分子的可转录的多核苷酸分子，可对本发明的实施有益处。构建构建体和将构建体导入细胞内从而将可转录的多核苷酸分子转录至能够引起基因抑制的分子中的方法在本领域是已知的。例如，在植物中使用构建体和反义方向的可转录的多核苷酸分子以调控基因表达的转录后基因抑制公开于美国专利NO5,107,065和5,759,829中，并且在植物中使用构建体和正义方向可转录的多核苷酸分子以调控基因表达的转录后基因抑制公开于美国专利NO5,283,184和5,231,020中。在植物细胞中表达可转录的多核苷酸也可用于抑制食用植物细胞的植物害虫，例如，从鞘翅目害虫分离的组合物美国专利公布说明

45、书CN102016049ACN102016059A9/20页11NOUS2007/0124836和从线虫害虫分离的组合物美国专利公布NOUS2007/0250947。植物害虫包括但不局限于节肢类害虫、线虫害虫和真菌或微生物害虫。导入本发明的构建体的示例性的可转录的多核苷酸分子包括，例如，来自于不同于目标物种之物种的DNA分子或基因，或起始于或存在于相同物种但通过遗传工程方法而不是传统的繁殖或育种技术掺入受体细胞中的基因。多核苷酸分子的类型包括但不局限于已经存在于植物细胞中的多核苷酸分子、来自另一植物的多核苷酸分子、来自不同机体的多核苷酸分子或外部产生的多核苷酸分子例如含有基因反义信使的多核苷酸

46、分子，或编码人工、合成的或另外的改良类型的转基因的多核苷酸分子。0050可选择性标记0051如在本文中所用术语“标记”是指任何可转录的多核苷酸分子，其表达或不表达可以某种方式筛选或评分。用于实施本发明的标记基因包括但不局限于，编码葡萄糖醛酸酶GUS，描述于美国专利5,599,670中、绿色荧光蛋白及其变体GFP，描述于美国专利5,491,084和6,146,826中、提供抗生素耐药性的蛋白质或提供除草剂耐受性的蛋白质的可转录的多核苷酸分子。可用的抗生素耐药性的标记，包括编码提供卡那霉素NPTII、潮霉素BAPHIV、链霉素或壮观霉素AAD，SPEC/STREP和庆大霉素AAC3和AACC4耐药

47、性的蛋白质的那些标记在本领域为已知的。已证实转基因植物的耐受性并且可应用本发明方法的除草剂，包括但不局限于氨基甲基膦酸、草甘膦、草丁膦GLUFOSINATE、磺酰脲类、咪唑啉酮、溴草腈、茅草枯、二氯甲氧苯酸、环己二酮、原卟啉原氧化酶抑制剂和异噁唑草酮ISOXAFLUTOLE除草剂。编码与除草剂耐受性有关的蛋白质的可转录的多核苷酸分子在本领域为已知的，并且包括但不局限于，编码5烯醇丙酮酸莽草酸3磷酸合成酶用于草甘膦耐受性的EPSPS，描述于美国专利5,627,061、5,633,435、6,040,497和5,094,945中的可转录的多核苷酸分子；编码草甘膦氧化还原酶和草甘膦N乙酰基转移酶GO

48、X描述于美国专利5,463,175中、GAT描述于美国专利公布NO2003/0083480中以及二氯甲氧苯酸单加氧酶美国专利公布NO2003/0135879中的可转录的多核苷酸分子；编码溴草腈腈水解酶用于溴草腈耐受性的BXN，描述于美国专利4,810,648中的可转录的多核苷酸分子；用于达草灭耐受性的编码八氢番茄红素去饱和酶CRTI的可转录的多核苷酸分子描述于MISAWA等人，PLANTJOURNAL，48338401993和MISAWA等人，PLANTJOURNAL，64814891994中、用于磺酰脲类除草剂耐受性的编码乙酰羟酸合成酶AHAS，也就是ALS的可转录的多核苷酸分子描述于SAT

49、HASIIVAN等人，NUCLACIDSRES，18218821931990，以及用于草丁膦和双丙氨磷耐受性的BAR基因描述于DEBLOCK等人，EMBOJOURNAL，6251325191987中。本发明的启动子分子可表达连接的可转录的多核苷酸分子，其编码草胺膦PHOSPHINOTHRICIN乙酰基转移酶、草甘膦抗性EPSPS、氨基糖苷磷酸转移酶、羟苯基丙酮酸酯脱氢酶、潮霉素磷酸转移酶、新霉素磷酸转移酶、茅草枯脱卤素酶、溴草腈抗性腈水解酶、邻氨基苯甲酸合成酶、芳氧基链烷酸酯双加氧酶、乙酰COA羧化酶、草甘膦氧化还原酶和草甘膦N乙酰基转移酶。0052包含于术语“可选择性标记”中的也有编码可分泌的标记的基因，其分泌可作为识别或选择转化细胞的方式。例子包括编码可通过抗体相互作用识别的可分泌的抗原的标记或甚至编码可催化检测的可分泌的酶的标记。可选择的分泌的标记蛋白质划分为说明书CN102016049ACN102016059A10/20页12几个类型，包括可被检测的例如通过ELISA小的可扩散的蛋白质、可在细胞外溶液中检测到的小的活性酶例如，淀粉酶、内酰胺酶、草胺膦转移酶或插入或禁锢在细胞壁中的蛋白质例如包括在例如延伸表达单元中发现的前导序列的蛋白质或者与烟草致病相关的蛋白质，也就是烟草PRS。其