来自于稀脉萍的新的丙二烯氧化物合酶.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102822337 A (43)申请公布日 2012.12.12 CN 102822337 A *CN102822337A* (21)申请号 201180016769.7 (22)申请日 2011.03.30 082354/2010 2010.03.31 JP C12N 15/09(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 9/88(2006.01) (71)申请人 株式会社资生堂 地址 日本东京都 (72)发明人 横山峰幸 上地沙

2、理 高木一辉 (74)专利代理机构 北京市中咨律师事务所 11247 代理人 曽祯 段承恩 (54) 发明名称 来自于稀脉萍的新的丙二烯氧化物合酶 (57) 摘要 本发明提供可在植物生长调节剂 (KODA) 的 制造中使用的高活性丙二烯氧化物合酶。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.09.28 (86)PCT申请的申请数据 PCT/JP2011/058108 2011.03.30 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/125785 JA 2011.10.13 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 6 页 附图 7 页 (19)中

3、华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 6 页 附图 7 页 1/1 页 2 1. 一种基因， 其包含选自以下的 (a) (e) 中的 DNA ： (a) 包含序列号 1 所示的碱基序列的 DNA ； (b) 编码包含序列号 2 所示的氨基酸序列的蛋白质的 DNA ； (c)编码包含在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、 取代或添加了1或数个氨基酸的氨 基酸序列， 且具有丙二烯氧化物合酶活性的蛋白质的 DNA ； (d) 与包含序列号 1 所示的碱基序列的 DNA 具有至少 90的同一性， 且编码具有丙二 烯氧化物合酶活性的蛋白质的 DNA ；

4、 及 (e) 与含有包含序列号 1 所示的碱基序列的 DNA 的互补碱基序列的 DNA 在高严格的条 件下杂交， 且编码具有丙二烯氧化物合酶活性的蛋白质的 DNA。 2. 一种表达载体， 其是使权利要求 1 所述的 DNA 与载体片段结合而成的。 3. 一种转化体， 其是将权利要求 2 所述的表达载体导入成为宿主的微生物、 动物细胞 或植物细胞而成的。 4. 一种丙二烯氧化物合酶的制造方法， 其特征在于， 培养权利要求 3 所述的转化体。 5. 一种蛋白质， 其是选自以下的 (a) (d) 中的蛋白质 ： (a) 包含序列号 2 所示的氨基酸序列的蛋白质 ； (b)包含在序列号2所示的氨基酸序

5、列中缺失、 取代或添加了1或数个氨基酸的氨基酸 序列， 且具有丙二烯氧化物合酶活性的蛋白质 ； (c) 由与包含序列号 1 所示的碱基序列的 DNA 具有至少 90的同一性的 DNA 编码， 且 具有丙二烯氧化物合酶活性的蛋白质 ； 及 (d) 由与包含序列号 1 所示的碱基序列的互补碱基序列的 DNA 在高严格的条件下杂交 的 DNA 编码， 且具有丙二烯氧化物合酶活性的蛋白质。 权 利 要 求 书 CN 102822337 A 2 1/8 页 3 来自于稀脉萍的新的丙二烯氧化物合酶 技术领域 0001 本发明涉及来自于稀脉萍的新的丙二烯氧化物合酶基因、 该丙二烯氧化物合酶基 因的表达产物、

6、 以及使用该丙二烯氧化物合酶基因的丙二烯氧化物合酶的制造方法。 背景技术 0002 丙二烯氧化物合酶是具有将氢过氧化的脂肪酸转换为丙二烯氧化物的活性的酶。 该丙二烯氧化物不稳定， 因此非酶性转换为酮醇体。 已知丙二烯氧化物合酶存在于植物、 动 物及酵母中。在植物的情况下， 认为存在于全部被子植物中， 例如， 在大麦、 小麦、 玉米、 棉 花、 茄子、 亚麻 ( 种等 )、 莴苣、 燕麦、 菠菜、 向日葵等中确认了其存在。通常已知在植物中， 丙二烯氧化物合酶有助于由于害虫和 / 或伤害引起的胁迫应答中的茉莉酸生物合成途径， 将 13- 羟基过氧化亚麻酸转换为 12,13- 环氧亚麻酸 ( 小泽理

7、香 , 蛋白質核酸酵素 ( 蛋白 质核酸酶 ),48(13):1786-17922003)。 0003 本发明者们发现具有花芽形成促进作用、 植物激活作用及包含它们的植物生长 调节作用的具有以下的结构的 - 酮醇不饱和脂肪酸 ( 以下， 称为 KODA)( 日本特开平 9-295908 号公报 )， 0004 0005 KODA 按照以下的路线在植物体内生成或酶生成。 0006 说 明 书 CN 102822337 A 3 2/8 页 4 0007 即， 使 9 位生成物特异性脂加氧酶 (LOX) 与 - 亚麻酸反应得到 9- 氢过氧化亚麻 酸， 接着使丙二烯氧化物合酶 (AOS) 与该 9-

8、 氢过氧化亚麻酸反应， 由此将 9 位的氢过氧基 脱水形成环氧基， 通过将该环氧化合物非酶地转换为酮醇体， 从而 KODA 生成 ( 日本特开平 11-29410 号公报、 日本特开 2001-131006 号公报及日本特开 2009-17829 号公报 )。 0008 已 知 KODA 存 在 于 各 种 植 物 种 中，并 已 知 受 到 胁 迫 的 稀 脉 萍 (Lemna paucicostata) 与其他植物相比释放出极高水平 ( 数百倍 ) 的 KODA( 日本特开平 11-29410 号公报 )。因此， 推测在稀脉萍中， 存在与其他植物的丙二烯氧化物合酶相比在活性方面优 异的丙二

9、烯氧化物合酶。 但是， 尚未从稀脉萍中分离出丙二烯氧化物合酶的cDNA， 序列也未 知。 0009 将 - 亚麻酸和 / 或亚油酸等作为起始原料通过酶合成制造 KODA 时， 丙二烯氧化 物合酶是必需的。 但是， 丙二烯氧化物合酶通常具有自杀底物的性质， 因此提高底物的浓度 的情况下， 反而导致KODA生成量的减少， 难以通过酶法大量生产KODA。 因此， 期望特定高活 性型的丙二烯氧化物合酶。 发明内容 0010 发明要解决的课题 0011 本发明要解决的课题是， 鉴别对 KODA 的生成有用的丙二烯氧化物合酶， 并分离 cDNA ； 提供整合有该 cDNA 的载体 ； 提供导入有该载体的转

10、化体 ； 以及使用该转化体提供丙 二烯氧化物合酶基因的表达产物 ； 进而提供使用该丙二烯氧化物合酶来酶法制造 KODA 和 / 或茉莉酸等化合物的方法。 0012 用于解决课题的方法 0013 本发明者们为了解决上述课题而进行了深入研究， 在由释放出其他植物的数百倍 的 KODA 的稀脉萍中分离新的丙二烯氧化物合酶 cDNA 时， 为了得到活性更高的丙二烯氧化 物合酶cDNA， 将稀脉萍株对于KODA生产能进行了筛选。 具体地说， 进行了62种稀脉萍株的 筛选， 结果令人惊讶地发现， 稀脉萍 SH 株具有其他稀脉萍株的平均 12 倍以上的 KODA 生产 能 ( 图 1)。 0014 本发明者

11、们由稀脉萍 SH 株分离丙二烯氧化物合酶 cDNA， 并整合到载体中， 将该载 体导入大肠杆菌并进行丙二烯氧化物合酶的蛋白质的表达， 试验了该丙二烯氧化物合酶蛋 白质的活性。明确了来自于稀脉萍 SH 株的丙二烯氧化物合酶具有高于现有使用的拟南芥 的丙二烯氧化物合酶的活性 ( 图 4)。 0015 因此， 本发明者们提供来自于稀脉萍 SH 株的新的丙二烯氧化物合酶基因以及由 该基因编码的蛋白质。具体地说， 本发明提供包含序列号 1 所示的碱基序列的 DNA 的基因、 包含与该 DNA 实际上相同的 DNA 的基因、 以及由这些基因编码的蛋白质。进而， 本发明者们 提供使上述 DNA 与载体片段结

12、合而成的表达载体。进而， 本发明还涉及由该表达载体转化 而得的微生物、 动物细胞或昆虫细胞等转化体。 本发明的丙二烯氧化物合酶如下获得 ： 培养 上述转化体， 回收该转化体， 由该转化体提取丙二烯氧化物合酶， 并进行纯化。 0016 发明的效果 0017 本发明的来自于稀脉萍 SH 株的丙二烯氧化物合酶显示与现有使用的丙二烯氧化 物合酶相比活性较高(图3)。 认为该高的活性是由于其没有通常已知的丙二烯氧化物合酶 说 明 书 CN 102822337 A 4 3/8 页 5 所具有的自杀底物的性质。因此， 通过使用本发明的丙二烯氧化物合酶， 可以在以 - 亚麻 酸和 / 或亚油酸等作为起始原料的

13、酶法合成法中， 高效地制造以 KODA 为代表的 - 酮醇不 饱和脂肪酸。 另外， 丙二烯氧化物合酶有助于茉莉酸生物合成途径， 因此可以高效地制造茉 莉酸。 附图说明 0018 图 1 是显示 62 种稀脉萍株中的 KODA 生产量的图。 0019 图 2A 是显示稀脉萍 SH 株的丙二烯氧化物合酶基因的核酸序列和氨基酸序列的 图。 0020 图 2B 是显示图 2A 的序列的继续的图。 0021 图 2C 是显示图 2B 的序列的继续的图。 0022 图 3A 是显示使用拟南芥 AOS 的 KODA 生成的 HPLC 色谱图的图。 0023 图 3B 是显示使用 SHLpAOS 的 KODA

14、 生成的 HPLC 色谱图的图。 0024 图 4 是显示在大肠杆菌中表达的来自于 SH 株的丙二烯氧化物合酶 (SHLpAOS) 和 作为对照使用的拟南芥的丙二烯氧化物合酶 (AtAOS) 的丙二烯氧化物合酶活性的比较图。 具体实施方式 0025 以下， 对于本发明的实施方式进行说明。本发明涉及来自于稀脉萍 SH 株的新的丙 二烯氧化物合酶基因及由该基因编码的蛋白质。具体地说， 本发明涉及包含序列号 1 所示 的碱基序列的 DNA、 和与该 DNA 实际上相同的 DNA 的基因。进而， 本发明涉及包含以下 DNA 的基因 ： 编码包含序列号 2 所示的氨基酸序列的蛋白质的 DNA、 编码包含

15、与该氨基酸序列实 际上相同的氨基酸序列的蛋白质的 DNA。进而， 本发明涉及作为上述 DNA 的片段的、 编码具 有丙二烯氧化物合酶活性的蛋白质的 DNA 片段。 0026 所谓 “实际上相同的 DNA” ， 是指与参考基准的 DNA 在碱基序列中具有至少 70的 同一性的 DNA。该同一性优选为至少 80、 至少 90、 至少 95、 至少 97、 至少 98、 至 少 99、 至少 99.5或至少 99.9。进而，“实际上相同的 DNA” 还是指与包含参考基准的 DNA 的互补碱基序列的 DNA 在高严格条件下杂交的 DNA。这些 “实际上相同的 DNA” 在被转 录、 翻译的情况下， 具

16、有与由参考基准的 DNA 编码的蛋白质相同的酶活性、 即丙二烯氧化物 合酶活性。 0027 杂交可按照公知的方法或依据该公知的方法的方法、 例如 J.Sambrook 等， Molecular Cloning 2nd,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989中记载的方法来进行， 另外 所谓高严格的杂交条件， 是指例如NaCl浓度为约1040mM、 优选为约20mM， 温度为约50 70， 优选为约 60 65的条件。 0028 本发明进一步涉及包含序列号 2 所示的氨基酸序列的蛋白质、 以及包含与该氨基 酸序列实际上相同的氨基酸序列的蛋白质。进而， 本发明还涉及由序列

17、号 1 所示的碱基序 列的 DNA、 或与该 DNA 实际上相同的 DNA 编码、 且具有丙二烯氧化物合酶活性的蛋白质。进 而， 本发明还涉及作为上述蛋白质的片段的、 具有丙二烯氧化物合酶活性的蛋白质片段。 0029 所谓 “包含实际上相同的氨基酸序列的蛋白质” ， 是指包含在参考基准的氨基酸序 列中缺失、 取代或添加了 1 或数个氨基酸的氨基酸序列， 而且具有包含参考基准的氨基酸 说 明 书 CN 102822337 A 5 4/8 页 6 序列的蛋白质的活性、 即丙二烯氧化物合酶活性的蛋白质。进而， 所谓 “包含实际上相同的 氨基酸序列的蛋白质” ， 是指包含与参考基准的氨基酸序列具有至少

18、 70的同一性的序列， 而且具有丙二烯氧化物合酶活性的蛋白质。 同一性优选为至少80、 至少90、 至少95、 至少 97、 至少 98、 至少 99、 至少 99.5或至少 99.9。 0030 在本说明书中， 序列号 1 表示来自于稀脉萍 SH 株的丙二烯氧化物合酶的碱基序 列， 序列号 2 表示该丙二烯氧化物合酶的氨基酸序列。将它们的具体序列示于图 2A C。 0031 所谓丙二烯氧化物合酶活性， 是指将被氢过氧化的脂肪酸转换为丙二烯氧化物的 酶活性。 0032 本发明中所谓丙二烯氧化物合酶或具有丙二烯氧化物合酶活性的蛋白质， 是指例 如通过后述的活性测定法确认了具有显著的丙二烯氧化物合

19、酶活性的蛋白质。包含例如， 与具有序列号 2 所示的氨基酸序列的丙二烯氧化物合酶的活性进行比较， 具有例如至少 10、 至少50、 至少70、 至少80、 至少90、 更优选为至少95的活性的蛋白质， 以及 具有 100以上、 例如 110以上、 120以上、 150以上、 200以上的活性的蛋白质。 0033 本发明的基因 (cDNA)， 例如可通过以下的步骤来得到。根据来自于植物的丙二烯 氧化物合酶的共有氨基酸序列来设计引物， 进行 RT-PCR 等， 得到 cDNA 片段。根据需要将该 片段用 32P 或地高辛等标记， 使用它们并使用 5 -RACE、 3 -RACE 或制作的 cDNA

20、 文库通过常 规方法进行筛选， 可得到丙二烯氧化物合酶基因 (cDNA) 全长。碱基序列的确定可通过桑格 法 (Sanger s method) 或化学降解法 (Maxam-Gilbert method) 等通常的方法进行。 0034 作为其他方法， 将来自于稀脉萍的丙二烯氧化物合酶使用硫酸铵分级和 / 或各种 色谱等的方法来纯化， 通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离， 并电转印于PVDF膜等， 切下用 考马斯亮蓝等的色素检测出的带， 然后通过蛋白质测序仪， 确定 N 末端氨基酸序列， 以该序 列为基础设计引物， 按照上述的方法通过进行PCR可得到丙二烯氧化物合酶基因(cDNA)全 长。 00

21、35 分离的基因 (cDNA) 例如通过公知的方法插入质粒、 病毒等来制备表达载体， 将其 导入宿主细胞例如微生物、 动物细胞、 植物细胞、 昆虫细胞等培养细胞中使其表达， 从而可 大量制备该蛋白质。 进而， 作为蛋白质表达系统， 还有时使用例如使用小麦胚芽提取物的无 细胞蛋白质表达系统。 0036 作为载体， 可使用 ： 来自于大肠杆菌 (Escherichia coli) 的质粒， 例如 pBR322、 pBR325、 pUC18、 pUC119 ； 来自于枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 的质粒， 例如 pUB110、 pTP5、 pC194 ； 来自于酵母的质粒，

22、例如pSH19、 pSH15 ； 噬菌体等噬菌体 ； 逆转录病毒、 牛痘 病毒、 杆状病毒等动物病毒 ； 以及 pA1-11、 pXT1、 pRC/CMV、 pRC/RSV、 pcDNAI/Neo 等， 但并不 限定于这些。在本发明中可使用市售的载体 pET41a(Novagen)。 0037 含有本发明的基因的表达载体可以通过在适当的载体的启动子的下游介由适当 的限制性位点以公知的方法连接本发明的基因来制造。作为本发明中使用的启动子， 只要 是与基因的表达中使用的宿主相对应的适当的启动子则没有特别限制。例如， 在使用动物 细胞作为宿主的情况下， 可举出 SR 启动子、 SV40 启动子、 L

23、TR 启动子、 CMV 启动子、 HSV-TK 启动子、 - 肌动蛋白启动子等。宿主为大肠杆菌等埃希氏菌属的细菌的情况下， 优选使用 trp 启动子、 lac 启动子、 recA 启动子、 PL 启动子、 lpp 启动子、 T7 启动子等， 宿主为杆菌 属菌的情况下， 优选使用SPO1启动子、 SPO2启动子、 pen启动子， 宿主为酵母的情况下， 优选 说 明 书 CN 102822337 A 6 5/8 页 7 使用 PHO5 启动子、 PGK 启动子、 GAP 启动子、 ADH 启动子等。宿主为昆虫的情况下， 优选为多 角体蛋白启动子、 P10 启动子等。根据需要， 在表达载体中可进一步

24、包含增强子、 剪接信号、 多聚 A 添加信号、 选择标志物、 SV40 复制起点等。 0038 宿主细胞可以是作为用于产生重组蛋白的宿主一直以来被利用的原核或真核细 胞的任一种， 例如没有限定地为哺乳动物细胞、 昆虫细胞、 植物细胞或真菌细胞， 并且优选 为细菌或真菌等的微生物。 “真菌” 的用语表示包含丝状菌及酵母的含义。适当的细菌的例 子可举出埃希氏菌属 (Escherichia) 例如大肠杆菌、 杆菌属例如枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、 链霉菌属 (Streptomyces) 例如变铅青链霉菌 (S.lividans) 等革兰氏阳性菌 ； 假单胞菌属 (Pseud

25、omonas) 例如洋葱假单胞菌 (P.cepacia) 等革兰氏阴性菌。另外， 该细 胞可为真菌、 即酵母或丝状菌的细胞。酵母例如可以是酵母属 (Saccharomyces) 的细胞， 例 如酿酒酵母 (S.cerevisiae)。丝状菌宿主生物例如可以是曲霉属 (Aspergillus) 种的株， 例如黑曲菌 (A.niger)。作为昆虫细胞， 可举出例如 Sf 细胞、 MG1 细胞、 BmN 细胞等。作为 动物细胞， 可举出例如猴细胞 COS-7 细胞、 Vero 细胞、 中国仓鼠细胞 CHO 等。在本发明中特 别优选利用大肠杆菌细胞。 0039 宿主细胞的转化可利用公知的方法， 例如氯

26、化钙法、 磷酸钙共沉淀法、 DEAE 葡聚糖 法、 脂质体转染法、 原生质体聚乙二醇融合法、 电穿孔法等， 根据利用的宿主细胞来选择适 当的方法即可。 0040 用适当的培养基培养得到的重组宿主细胞， 由培养液以惯用的步骤回收目标蛋白 质， 所述惯用的步骤例如， 没有限定地通过离心或过滤由培养液分离细胞， 根据需要破碎细 胞， 通过硫酸铵等盐使上清液或滤液的蛋白质性成分沉淀， 接着进行各种色谱步骤， 例如进 行离子交换色谱、 亲和色谱等。为了实现目标蛋白质的回收， 可使用包含标签序列的载体。 作为标签， 可举出 His 标签、 GST 标签、 c-Myc 标签、 HA 标签等。 0041 如果

27、在编码本发明的蛋白质的 DNA 的上游连接用于分泌的微生物用或动物用 的适当的信号序列， 则可使该蛋白质分泌表达到培养基中。改变为这样的分泌型的 DNA， 在容易纯化分泌于培养基中的该蛋白质的方面是有用的。作为该信号序列的例子， 可举 出大肠杆菌的情况下的 pelB 信号 (S.P.Lei 等， J.Bacteriology,169:4379-4383,1987 )、 酵母的情况下的 因子信号 (A.J.Brake,Yeast Genetic Engineering,p269Butter worth,1989)、 动物细胞的情况下的免疫球蛋白的信号 SG-1(H.Maeda 等、 Hum.An

28、tibod. Hybridomas,2:124-134,1991)、 C25 的信号 (WO94/20632) 等。 0042 丙二烯氧化物合酶活性的测定可以如下进行 ： 使 9 位生成物特异性脂加氧酶作用 于 - 亚麻酸， 接着在作为酶生成物的 9- 羟基过氧化亚麻酸 (9-HPOT) 中加入一定量的丙 二烯氧化物合酶， 由此生成 KODA， 通过 HPLC 定量地分析所生成的 KODA。 0043 本发明的蛋白质， 例如作为用于在各种的亚油酸、 亚麻酸衍生物等的合成中利用 的试剂可以是有用的。具体地说， 本发明的蛋白质作为由亚油酸和 / 或亚麻酸酶法合成作 为植物生长调节剂有用的-酮醇不饱

29、和脂肪酸、 特别是KODA时使用的酶是有用的。 另外， 考虑通过将本发明的基因导入植物体中， 可控制通过存在于植物体内的亚油酸和 / 或亚麻 酸的丙二烯氧化物合酶进行的代谢。 0044 以下， 通过实施例更具体地说明本发明。 但是， 本发明的技术的范围不受这些实施 例等限定。 说 明 书 CN 102822337 A 7 6/8 页 8 0045 实施例 0046 实施例 1 ： KODA 高生产稀脉萍株的筛选 0047 准备从各种场所采集的 62 种稀脉萍， 在稀释为 1/2 倍的 Hunter 培养基中， 在来自 于 24 25的日光色荧光灯的连续的光照射的下进行传代培养。稀释为 1/2

30、倍的 Hunter 培养基含有以下的成分 ： 0048 0049 使用 KOH(50 ) 调整至 pH 值 6.2 6.5。 0050 将增殖的稀脉萍在滤纸上展开， 放置 2 小时后， 在水中浸渍 1 小时。将该水用高 速液相色谱 (HPLC ； 柱 :TYPE UG1205m SIZE 4.6mm I.D250mm ； 保护过滤器 :INERTSTL 4.6mm50mm ； 洗脱液 :50% 乙腈 +0.1% 三氟乙酸 ； 条件 : 吸光度的波长 210(nm)， 流 速 1.ml/ 分钟， 柱温度 40 ) 分析 KODA 的浓度。全部的稀脉萍株的 KODA 生产量平均为 4.97M。其中

31、， 稀脉萍 SH 株生产 60.2M 的 KODA， 多达全部株的平均 KODA 生产量的约 12 倍， 实现了极高的生产量 ( 图 1)。 0051 实施例 2 ： 来自于稀脉萍株的丙二烯氧化物合酶的克隆化及其活性测定 0052 由稀脉萍SH株(Lemna paucicostata,SH)使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN) 提取总RNA后， 由1.8g的总RNA使用LongRange 2StepRT-PCR Kit(Qiagen)通过RT-PCR 法来合成 cDNA。将合成的 cDNA 使用以下所示的来自于拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 的引

32、物， 将 PCR 的退火温度较低地设定为 45， 得到来自于 SH 株的丙二烯氧化物合酶 (SHLpAOS) 的一部分序列信息。 0053 AOS- 正向 5 -GGA ACT AAC CGG AGG CTA CCG-3 ( 序列号 3) 0054 AOS- 反向 5 -CCG TCT CCG GTC CAT TCG ACC ACA A-3 ( 序列号 4) 说 明 书 CN 102822337 A 8 7/8 页 9 0055 以 该 序 列 信 息 为 基 础， 通 过 3或 5 RACE 法 (cDNA 末 端 快 速 扩 增， Rapid Amplification of cDNA e

33、nd) 确定全长序列。 0056 3 -RACE 用引物 0057 SH-3 -TP ： 5 -TCTGGGCAGACTCTTCTTTGGAG-3 ( 序列号 5) 0058 5 -RACE 用引物 0059 SH-5 -TP ： 5 -CCGGCTTGCGCTATATATCTGAGAATT-3 ( 序列号 6) 0060 3 -RACE 0061 以上述实验中所得到的 SH 株的总 RNA2g 作为模板， 使用 CapFishingTM target full-length cDNA cloning Kit(Seegene) 合成 cDNA。将该 cDNA 制成模板溶液， 试剂盒内 接头引物

34、 (3 -RACE 引物 ) 和 SH-3 -TP 分别进行 PCR。 0062 5 -RACE 0063 以上述实验中得到的 SH 株的总 RNA 2g 作为模板， 使用 CapFishingTM target full-length cDNA cloning Kit(Seegene) 合成 cDNA。将该 cDNA 制成模板溶液， 试剂盒内 接头引物 (5 -RACE 引物 ) 和 SH-5 -TP 分别进行 PCR。 0064 确定 PCR 产物的序列， 使用以下所示的引物和上述的 cDNA 进行 PCR， 将 cDNA 的全 序列亚克隆到 pTAC-2 载体 (BioDynamics)

35、 中。另外， 为了插入表达载体中， 在 5 侧添加 NcoI 位点， 在 3 侧添加 XhoI 位点。 0065 SHAOS-F:5 -CCGCGCCA TGGAGAAGAGAA TGTC TG TCTCGC-3 ( 序列号 7) 0066 SHAOS-R:5 -CCGCGCTCGAGGTTGAATAAGCACGAGTGT-3 ( 序列号 8) 0067 其结果由 SH 株得到 1 个序列的新的 AOS 同系物 ( 核酸序列 1443bp、 氨基酸序列 480aa、 推定分子量53.3KDa)(图2A-C)。 将通过该稀脉萍SH株得到的丙二烯氧化物合酶命 名为 SHLpAOS。 0068 通过

36、上述的方法整合到 pTAC-2 载体中， 分别用 NcoI、 XhoI 切断 SHLpAOS 序列后， 导入市售的蛋白质表达用载体 pET41a(Novagen) 中， 得到稀脉萍丙二烯氧化物合酶表达用 质粒pET41A/SHLpAOS。 将该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)株(Novagen)。 接着， 在含有30mg/ L 的卡那霉素的 LB 培养基 3ml 中接菌， 在 37以 250 转 / 分钟进行一夜振荡培养。对含有 同浓度的卡那霉素和 1% 葡萄糖的 LB 培养基 10ml 添加 100l 该培养液， 在 37以 250 转 / 分钟进行 3 4 小时振荡培养。由该培养液 25

37、ml 用离心分离回收菌体， 移至含有 0.1mM 异丙基-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(和光纯药)、 30mg/L的卡那霉素的TB培养基50ml中， 在 25以 250 转 / 分钟进行一夜振荡培养， 从而进行丙二烯氧化物合酶的诱导。培养结束 后进行离心分离， 对菌体湿重 1g， 添加 5ml 的 BugBusterTM(Novagen) 溶解菌体。其后进行 离心分离 (9000 转 / 分钟、 5 分钟、 4 )， 回收上清， 制成酶液。使用该酶液进行 KODA 制造 中的活性试验。 0069 KODA 制造中的活性试验， 制成 5mM 亚麻酸溶液 ( 溶解于 0.1 Tween80 溶液 )，

38、在 pH 值 7 的条件下， 与由稻的胚芽提取的脂加氧酶在室温下反应 10 分钟， 合成 9- 羟基过氧 化亚麻酸 (9-HPOT) 溶液。对该 9-HPOT 反应溶液 20l， 添加 SHLpAOS 蛋白质或来自于拟 南芥的 AOS(AtAOS) 蛋白质 0.32ng， 在室温下反应 10 分钟。反应后， 在 50通过 3 分钟的 加热处理终止反应。用 HPLC 分析 10l 的该溶液。HPLC 分析在如下条件下进行 ： 柱 ： (CAPCELL PAK)C-18UG120(4.6250mm， 资生堂 )， 柱温度 ： 40， 移动相 ： 50 说 明 书 CN 102822337 A 9

39、8/8 页 10 乙腈溶液 (0.02 TFA)， 流速 ： 1ml/ 分钟， 检测波长 ： 210nm。将该 HPLC 的结果示于图 3(A、 B)。如 HPLC 图所示， 确认了 KODA 的峰， 显示来自于稀脉萍 SH 株的丙二烯氧化物合酶可用 于 KODA 制造。另外， SHLpAOS 蛋白质比 AtAOS 蛋白质活性强至近 7 倍 ( 图 4)。 0070 进行由稀脉萍 SH 株得到的 SHLpAOS 的动力学分析。使用 40mMM 磷酸缓冲液 (pH 值 7.5)、 1 EtOH 的反应液， 在反应温度为 25下进行。作为底物的 9-HPOT 以 5 53M 的底物浓度进行试验。另

40、外， 成为底物的 9-HOPT 作为 EtOH 溶液添加， 调制成 EtOH 终浓度 为 1。将反应液 100l 加入比色杯中， 使用 SmartSpec PLUS 分光光度计 (Bio-Rad)， 对 234nm 的吸光度的减少， 以 2 秒的间隔经时地进行 1 分钟扫描。由测定的 A234算出反应产物 的量 (E 25000)。动力学参数使用 Hanes-Woolf 作图 (S/V VersusS 作图 ) 来确定。 其结果如表1所示， 在SHLpLOX中， Km值大幅低于AtAOS， 与9-HPOT的亲和性高至约5倍。 另 外， Vmax为 AtAOS 的约 2.8 倍， 非常高。Kca

41、t值也是 SHLpAOS 高至 AtAOS 的约 2.8 倍， 反应周 转非常有效地发生。Kcat/Km值， SHLpAOS 为 AtAOS 的约 14 倍。认为 SHLpAOS 与 AtAOS 相比， 是在实用的KODA制造中非常有用的AOS。 由以上可明确， 由稀脉萍SH株克隆化的SHLpAOS， 是目前为止尚未报告的、 具有非常高的活性的 AOS。 0071 表 1SHLpAOS 和 AtAOS 的动力学参数 0072 说 明 书 CN 102822337 A 10 1/6 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 102822337 A 11 2/6 页 12 0003 序 列

42、表 CN 102822337 A 12 3/6 页 13 0004 序 列 表 CN 102822337 A 13 4/6 页 14 0005 序 列 表 CN 102822337 A 14 5/6 页 15 0006 序 列 表 CN 102822337 A 15 6/6 页 16 序 列 表 CN 102822337 A 16 1/7 页 17 图 1 说 明 书 附 图 CN 102822337 A 17 2/7 页 18 图 2A 说 明 书 附 图 CN 102822337 A 18 3/7 页 19 图 2B 说 明 书 附 图 CN 102822337 A 19 4/7 页 20 图 2C 说 明 书 附 图 CN 102822337 A 20 5/7 页 21 图 3A 说 明 书 附 图 CN 102822337 A 21 6/7 页 22 图 3B 说 明 书 附 图 CN 102822337 A 22 7/7 页 23 图 4 说 明 书 附 图 CN 102822337 A 23