用于检测BRAF基因V600E突变的引物、探针、试剂盒及方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102816851 A (43)申请公布日 2012.12.12 CN 102816851 A *CN102816851A* (21)申请号 201210310313.8 (22)申请日 2012.08.29 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 苏州旷远生物分子技术有限公司 地址 215558 江苏省苏州市常熟市高新区湖 山路 99 号常熟国家大学科技园求真楼 T2-409 室 (72)发明人 王进 赵小龙 何晓辉 刘乔 陈允斌 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 32207 代理人 汪旭东 (54) 发

2、明名称 用于检测BRAF基因V600E突变的引物、 探针、 试剂盒及方法 (57) 摘要 本发明提供了一种基于实时荧光定量 PCR 技 术平台的 BRAF 基因突变检测的引物、 探针、 试剂 盒及方法， 用于检测 BRAF 基因 V600E 突变。本发 明快速、 成本低， 具有临床检测推广价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 3 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种用于检测BRAF基因V600E突变的引物与探针, 其特征在于

3、所述检测引物及探 针根据 BRAF 基因 V600E 突变位点设计， 序列如下所示 ： 检测正向引物 ： 5 - AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACACA -3 ； 检测反向引物 ： 5 - CTTTCTAGTAACTCAGCAGCATC -3 ； 检测荧光探针 ： 5 荧光基团 - TCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCT -3 淬灭基团。 2. 一种用于检测 BRAF 基因 V600E 突变的内控引物及内控荧光探针 , 其特征在于所 述内控引物及探针根据 GAPDH 基因保守序列设计， 序列如下所示 ： 内控正向引物 ： 5 -CGCCCTCTTAATGGGGAGG

4、TGG-3 ； 内控反向引物 ： 5 -CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3 ； 内控荧光探针 ： 5 荧光基团 -TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3 淬灭基团。 3.如权利要求1-2所述的引物对及相应荧光探针， 其特征在于所述荧光探针5 端的荧 光基团为 FAM、 TET、 VIC、 HEX 或 ROX， 3 端的淬灭基团为 BHQ -1、 BHQ -2、 Dabcyl、 Eclipse、 或 TAMRA。 4. 一种用于检测 BRAF 基因 V600E 突变的试剂盒， 其特征在于所述试剂盒包括权利要 求 1 所述的检测引物及其相应探针。 5. 如权利要求4所述

5、的试剂盒， 其特征在于所述试剂盒还包括权利要求2所述的内控 引物对及相应荧光探针。 6.一种BRAF基因V600E突变的检测方法， 所述方法包括使用权利要求1所述的引物及 探针。 7. 如权利要求 6 所述的检测方法， 其特征在于所述方法还包括使用权利要求 2 所述的 引物及探针。 8.一种BRAF基因V600E突变的检测方法， 所述方法包括使用权利要求4-5所述的试剂 盒。 9. 权利要求 1-2 所述的引物及探针在检测 BRAF 基因 V600E 突变中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102816851 A 2 1/7 页 3 用于检测BRAF基因V600E突变的引物、 探针、 试剂盒

6、及方法 技术领域 0001 本发明属于生物医学临床分子检测领域， 具体涉及用于检测BRAF基因V600E突变 的引物、 探针、 试剂盒及其使用方法。 背景技术 0002 BRAF 基因是一种癌基因， 与 ARAF 和 RAF1(CRAF) 基因同属于 RAF 家族， 其编码的 BRAF蛋白是一种丝/苏氨酸特异性激酶， 是RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK信号通路中的重要转导 因子， 参与细胞内多种生物学事件的调控， 如细胞生长、 分化和凋亡等。 0003 BRAF 基因位于 7q34， 长约 190kb， 转录 mRNA 长 2.5kb， 编码 783 氨基酸的蛋白， 相 对分子质量为

7、9400095000。BRAF 蛋白由 783 个氨基酸组成， 功能上从 N 端到 C 端为 RAS 结合区、 富半胱氨酸区(Cys)、 甘氨酸环(Gloop)和激活区。 在绝大多数组织和细胞类型中， BRAF 是 MEK/ERK 最为关键的激活因子。它主要有 CR1、 CR2 和 CR33 个保守区。其中 CR1 区 含RBD区(RAS蛋白结合区)和富含半胱氨酸区(Cys) ； CR3区为激酶结构域， 含甘氨酸环(G loop)， 为 ATP 结合位点和激活区， 该区 T598 和 S601 两个位点的磷酸化对 BRAF 蛋白的激活 至关重要， 这两个位点氨基酸的置换将导致激酶持续性激活。

8、0004 研究表明， 在多种人类恶性肿瘤中， 如恶性黑色素瘤、 结直肠癌、 肺癌、 甲状腺癌、 肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的 BRAF 突变。BRAF 突变主要有两种类型 ： (1). 11% 位于 Exon11 上的甘氨酸环， 如 G463、 G465、 G468 等的点突变 ； (2). 89的突变发生在 Exon15 上 的激活区， 其中约92位于第1799位点T突变为A， 导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(即 V600E)。V600E 突变能模拟 T598 和 S601 两个位点的磷酸化作用， 使 BRAF 蛋白激活。BRAF 蛋白激活后导致 MEK/ERK 的激活， 通过转录物或非转

9、录物的方式影响肿瘤进展。因此， 及时 检测 BRAF 突变情况， 对早期筛查肿瘤病人以及对肿瘤个体化治疗、 预后将具有重要的指导 意义。 0005 多年来， 国内外对 BRAF 基因突变进行检测大多采用 DNA 直接测序法。由于测序 法的灵敏度只能检测低至 20% 含量的突变， 由于肿瘤组织取材及肿瘤细胞突变发生率的不 同， 导致测序法往往不能检出 BRAF 突变， 造成假阴性的结果。另外， 测序过程周期长、 通量 较低， 亦不适用于大量人群的快速筛选， 难以实现大规模推广。 发明内容 0006 本发明针对现有技术检测 BRAF 基因突变时灵敏度低、 周期长、 数据分析过程繁琐 等不足， 提供

10、了一种基于实时荧光定量PCR技术平台的BRAF基因突变检测的引物、 探针、 试 剂盒及方法， 用于检测BRAF基因V600E突变， 本发明快速、 成本低， 具有临床检测推广价值。 0007 为达到上述目的， 本发明采用的技术方案是 ： 一种用于检测BRAF基因V600E突变的引物与探针, 其特征在于所述检测引物及探针 根据 BRAF 基因 V600E 突变位点设计， 序列如下所示 ： 检测正向引物 ： 5 - AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACACA -3 ； （ SEQ ID No.1） 说 明 书 CN 102816851 A 3 2/7 页 4 检测反向引物 ： 5 -

11、CTTTCTAGTAACTCAGCAGCATC -3 ； （ SEQ ID No.2） 检测荧光探针 ： 5 荧光基团 - TCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCT -3 淬灭基团 （ SEQ ID No.3） 。 0008 本发明还提供了一种用于检测BRAF基因V600E突变的内控引物及内控荧光探针, 其特征在于所述内控引物及探针根据 GAPDH 基因保守序列设计， 序列如下所示 ： 内控正向引物 ： 5 -CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3 ； （ SEQ ID No.4） 内控反向引物 ： 5 -CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3 ； （ SEQ

12、ID No.5） 内控荧光探针 ： 5 荧光基团 -TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3 淬灭基团 （ SEQ ID No.6） 。 0009 上述检测 BRAF 基因 V600E 突变的探针及内控荧光探针 5 端的荧光基团为适用于 荧光 PCR 定量分析的常规使用的荧光报告基团， 优选 FAM， TET， VIC， HEX 或 ROX， 3 端的淬灭 基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光淬灭基团， 优选BHQ -1、 BHQ -2、 Dabcyl、 Eclipse 或 TAMRA， 更优选的方案为检测荧光探针的 5 端连有的荧光基团为 FAM， 3 端连有 的淬灭基团为

13、 Dabcyl ； 内控荧光探针的 5 端连有的荧光基团为 ROX， 3 端连有的淬灭基团 为 BHQ-2。 0010 本发明还提供了一种用于检测 BRAF 基因 V600E 突变的荧光 PCR 试剂盒， 包括本 发明上述检测 BRAF 基因 V600E 突变的检测引物和相应的荧光探针和使用说明书。具体的 说， 包含检测 BRAF 基因 V600E 突变的突变特异性 PCR 反应液， PCR 反应液包含了 PCR 反应 必须的缓冲液、 镁离子、 dNTP 等物质外， 还包含上述检测引物与探针。上述突变特异性检测 的 PCR 反应液包含的检测引物与探针的序列如下 ： 检测正向引物 ： 5 - A

14、AATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACACA -3 ； 检测反向引物 ： 5 - CTTTCTAGTAACTCAGCAGCATC -3 ； 检测荧光探针 ： 5 荧光基团 - TCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCT -3 淬灭基团。 0011 上述试剂盒的突变特异性 PCR 反应液优选方案中， 除了包括检测 BRAF 基因 V600E 突变的检测引物和相应的荧光探针外， 还包括一对内控引物及相应荧光探针， 内控引物与 内控探针的序列如下 ： 内控正向引物 ： 5 -CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3 ； 内控反向引物 ： 5 -CTTTGGGGCTCACCAT

15、GTAGCACT-3 ； 内控荧光探针 ： 5 荧光基团 -TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3 淬灭基团。 0012 上述试剂盒中检测 BRAF 基因 V600E 突变的探针以及内控荧光探针 5 端的荧光 基团可以为适用于荧光 PCR 定量分析的常规使用的荧光报告基团， 优选 FAM， TET， VIC， HEX 或 ROX， 3 端的淬灭基团为适用于荧光 PCR 定量分析的常规使用的荧光淬灭基团， 优选 BHQ -1、 BHQ -2、 Dabcyl、 Eclipse 或 TAMRA， 更优选的方案为检测荧光探针的 5 端连有的荧光 基团为 FAM， 3 端连有的淬灭基团为 Da

16、bcyl ； 内控荧光探针的 5 端连有的荧光基团为 ROX， 3 端连有的淬灭基团为 BHQ-2。 0013 上述试剂盒使用说明书包含对PCR扩增条件的描述， 优选的PCR扩增条件为 ： 预变 性的条件为 ： 温度为 95， 时间为 3 分钟 ； PCR 反应由第一阶段和第二阶段构成 ： 第一阶段由 10 次扩增循环构成， 其条件为 ： 变性 ： 温度为 95， 时间为 20 秒 ； 说 明 书 CN 102816851 A 4 3/7 页 5 退火 ： 起始温度为 56， 时间为 30 秒 ； 延伸 ： 温度为 65， 时间为 45 秒 ； 第二阶段由 30 次扩增循环构成， 其条件为 ：

17、 变性 ： 温度为 95， 时间为 20 秒 ； 退火 ： 温度为 56， 时间为 30 秒 ；（设置荧光信号采集） 延伸 ： 温度为 65， 时间为 45 秒。 0014 本发明还提供了一种利用上述引物和荧光探针或者含有上述引物和探针的荧光 PCR 试剂盒进行检测 BRAF 基因 V600E 突变的方法， 步骤包括 （1） 引物和探针的设计 ： 根据美国国立生物技术信息中心 NCBI 的核酸序列数据库 GeneBank 公开的 BRAF 基因的参考序列 （NG_007873.2） 以及 dbSNP 数据库公开的 BRAF 基 因 V600E 突变 （dbSNP:rs113488022） 信息

18、 , 采用 ABI 公司的 Primer Express 3.0 软件设 计检测 BRAF 基因 V600E 位点突变的引物与探针 , 具体如下 ： 检测正向引物 ： 5 - AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACACA -3 ； 检测反向引物 ： 5 - CTTTCTAGTAACTCAGCAGCATC -3 ； 检测荧光探针 ： 5 荧光基团 - TCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCT -3 淬灭基团。 0015 为了监测反应体系的有效性， 在检测体系内加入内控引物与探针， 本发明选取人 类基因GAPDH的一段保守序列 （其GeneBank参考序列编号为 ： NG_00

19、7073.2） ， 采用ABI公司 的 Primer Express 3.0 软件设计检测引物及探针， 具体序列如下所示 ： 内控正向引物 ： 5 -CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3 ； 内控反向引物 ： 5 -CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3 ； 内控荧光探针 ： 5 荧光基团 -TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3 淬灭基团。 0016 （2） 待测样本处理和模板提取 2a. 从待检测者体内采集组织样本 ； 2b. 从组织样本中获取 DNA， 推荐使用商业化的试剂盒提取 DNA ； 2c. 测定 DNA 浓度和纯度， 要求浓度 10100ng

20、/l ； OD260nm/OD280nm=1.62.0。 0017 （3） 荧光 PCR 扩增 ： 将待检测模板 DNA 与一定量的 Taq DNA 聚合酶加入上述 BRAF 基因 V600E 突变特异性 检测的 PCR 反应液内， 在荧光 PCR 管内混合均匀离心后， 放入荧光定量 PCR 仪器按照特定的 温度循环及信号采集程序进行 PCR 反应， 优选采用以下温度循环及信号采集程序进行 PCR 反应 ： 预变性的条件为 ： 温度为 95， 时间为 3 分钟 ； PCR 反应由第一阶段和第二阶段构成 ： 第一阶段由 10 次扩增循环构成， 其条件为 ： 变性 ： 温度为 95， 时间为 20

21、 秒 ； 退火 ： 起始温度为 56， 时间为 30 秒 ； 延伸 ： 温度为 65， 时间为 45 秒 ； 第二阶段由 30 次扩增循环构成， 其条件为 ： 变性 ： 温度为 95， 时间为 20 秒 ； 退火 ： 温度为 56， 时间为 30 秒 ；（设置荧光信号采集） 说 明 书 CN 102816851 A 5 4/7 页 6 延伸 ： 温度为 65， 时间为 45 秒。 0018 （4） 分析结果 在上述 PCR 反应体系与温度循环程序条件下， 观察 BRAF 基因 V600E 突变特异性 PCR 反 应体系内检测荧光信号是否形成对数扩增 “S” 型曲线， 如果形成对数扩增 “S”

22、型曲线则该 待检 DNA 样本含有 V600E 突变。 0019 本发明还提供了一种检测 BRAF 基因 V600E 突变的引物、 探针、 试剂盒及方法在检 测 BRAF 基因 V600E 突变中的应用。 0020 本发明所述技术方案中的有关内容解释如下 ： 1、 本发明所述技术方案中 ： 所述引物 （primer） 是指由一定数量的 dNTP 构成的寡核苷 酸序列， 通常由 DNA 合成仪人工合成， 合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化。 在聚合酶链式反应中， 引物可与待扩增目的核酸链上与之互补的区域结合， 其功能是作为 核苷酸聚合作用的起始点， 在引物的 3 -OH 上， 核苷酸以

23、二酯键形式进行合成， 因此引物的 3 -OH 必须是游离的。DNA 聚合酶可由其 3 端开始进行延伸， 合成新的核酸链。 0021 2、 本发明工作原理是 ： 等位基因特异PCR (Allele Specific PCR, AS-PCR)， 又称 为等位基因特异性扩增法 (Allele Specific Amplification, ASA) 或者扩增受阻突变系 统(Amplification Refractory Mutation System ARMS-PCR)， 其基本原理是由于Taq DNA 聚合酶缺少 3 5 外切酶活性， 在进行 PCR 反应时， 若引物 3 端形成错配， 链延伸反

24、应就 会因为 3 ， 5 - 磷酸二酯键形成的障碍而受阻， 导致 PCR 产物量急剧减少， 在一定扩增循环 内， 不会检测出特异的扩增产物 ； 反之， 3 端配对则能够检测出扩增产物。于是， 针对已知 的突变位点， 将其突变碱基设计于检测引物的 3 端， 扩增反应后， 通过凝胶电泳观察产物的 有无即可判断该位点是否含有突变。 0022 荧光定量 PCR 是 ( Real-time PCR) 是 1996 年由美国 Applied Biosystems 公 司推出的一种新定量实验技术， 在 PCR 扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光 探针， 该探针被称 “TaqMan探” ， 为一寡核

25、苷酸， 两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭 荧光基团。探针完整时， 报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收 ； 刚开始时 , 探针结合 在 DNA 任意一条单链上 ； PCR 扩增时， Taq 酶的 5 3 外切酶活性将探针酶切降解， 使报 告荧光基团和淬灭荧光基团分离， 从而荧光监测系统可接收到荧光信号， 即每扩增一条 DNA 链， 就有一个荧光分子形成， 实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。 0023 通过基于荧光探针的实时荧光 PCR 技术检测突变特异性反应体系的产物， 在特定 的扩增循环条件下， 检测荧光信号形成对数扩增 “S” 型曲线则表明该样本含有突变。 0024

26、2、 本发明所述技术方案中， 所述荧光探针是一种寡聚核苷酸探针， 荧光基团连接 在探针的 5 末端， 而淬灭基团则在 3 末端， 通常采用 DNA 合成仪人工合成， 合成后经聚丙 烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化。目前常用的荧光基团有 FAM， TET， VIC， HEX， ROX 等。 淬灭基团有 BHQ -1、 BHQ -2、 Dabcyl、 Eclipse、 TAMRA 等。 0025 3. 本发明所述技术方案中， 所述的内控引物及其相应的探针可以用来监测反应 有效性的指标， 用以判断是否存在模板质量、 机器故障、 试剂稳定性等因素影响试验结果的 情况。正常情况下， PCR 正常扩增会形

27、成的指数级扩增曲线， 形象的描述为 “S” 型扩增曲线， 表明体系正常扩增。当特异性 PCR 反应体系内目的检测荧光信号形成对数扩增 “S” 型曲线 时， 为阳性结果， 也说明 PCR 体系扩增正常， 无需采用内控引物及其相应的探针进行结果的 说 明 书 CN 102816851 A 6 5/7 页 7 验证。然而， 当特异性 PCR 反应体系内目的检测荧光信号未形成对数扩增 “S” 型曲线， 检测 为阴性结果， 但也有可能是模板质量、 机器故障、 试剂稳定性等因素影响试验结果， 这种情 况下， 可以采用内控引物及其相应的探针进行排除。当特异性 PCR 反应体系内目的检测荧 光信号未形成对数扩

28、增 “S” 型曲线， 而内控信号形成正常对数扩增 “S” 型曲线时， 可以验证 阴性结果的准确性。而当特异性 PCR 反应体系内目的检测荧光信号未形成对数扩增 “S” 型 曲线， 且内控信号也未形成正常对数扩增 “S” 型曲线时， 则说明实验条件或仪器上出现问题 影响试验结果。 0026 由于上述技术方案运用， 本发明与现有技术相比具有下列优点和效果 ： 1、 本发明技术方案采用特殊设计的引物与探针， 其 PCR 检测特异性非常高， 并且采用 实时荧光 PCR 技术， 检测结果判读容易。 0027 2、 本发明技术方案中的检测引物与探针价格低廉， 而且在实验过程中不需测序， 在节省了检测成本的

29、同时， 大大缩短了检测周期， 提高了检测的效率。 0028 3、 本发明采用实时荧光 PCR 技术平台， 可实现高通量检测。 附图说明 0029 附图 1 为某肿瘤组织样本 BRAF 基因 V600E 突变检测图。 0030 附图 2 为某正常组织样本 BRAF 基因 V600E 突变检测图。 具体实施方式 0031 在本发明中所使用的术语， 除非另有说明， 一般具有本领域普通技术人员通常理 解的含义。 0032 下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解， 这些实施例只 是为了举例说明本发明， 而非以任何方式限制本发明的范围。 0033 在以下实施例中， 未详细描述的各种过程和

30、方法是本领域中公知的常规方法， 通 常采用常规条件如 Sambrook 等人， 分子克隆 ： 实验室手册 （NewYork ： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989） 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的方法。本发明所使用的 荧光定量 PCR 仪型号为 ABI 7500 或 BioRad CFX96。 0034 实施例 1. 引物和探针的设计 ： 根据美国国立生物技术信息中心 NCBI 的核酸序列数据库 GeneBank 公开的 BRAF 基 因 的 参 考 序 列 （NG_007873.2）以 及 dbSNP 数 据 库 公 开 的 BRAF

31、基 因 V600E 突 变 （dbSNP:rs113488022） 信息 , 采用 ABI 公司的 Primer Express 3.0 软件设计检测 BRAF 基 因 V600E 位点突变的引物与探针 , 具体如下 ： 检测正向引物 ： 5 - AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACACA -3 ； 检测反向引物 ： 5 - CTTTCTAGTAACTCAGCAGCATC -3 ； 检测荧光探针 ： 5 FAM- TCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCT -3 Dabcyl。 0035 为了监测反应体系的有效性， 在检测体系内加入内控引物与探针， 本发明选取人 类基因GA

32、PDH的一段保守序列 （其GeneBank参考序列编号为 ： NG_007073.2） ， 采用ABI公司 的 Primer Express 3.0 软件设计检测引物及探针， 具体序列如下所示 ： 内控正向引物 ： 5 -CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3 ； 说 明 书 CN 102816851 A 7 6/7 页 8 内控反向引物 ： 5 -CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3 ； 内控荧光探针 ： 5 ROX-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3 BHQ-2。 0036 实施例 2. 引物的制备 将设计好的引物及探针序列发至合成公司合成， 一般采

33、用仪器自动化学合成， 需提供 合成检验合格报告。 0037 实施例 3. 检测 BRAF 基因 V600E 突变的荧光 PCR 试剂盒的准备 制备检测 BRAF 基因 V600E 突变特异性反应液， 该 PCR 反应液包含了 PCR 反应必须的缓 冲液、 镁离子、 dNTP 等物质外， 还包含了突变检测引物与探针及内控引物与探针。突变检测 PCR 反应液各组分浓度及包含的引物与探针的序列信息如下 ： 表 1.PCR 反应液组分 反应液组分浓度 缓冲液10 镁离子15mM dNTP（A/T/G/C）各 20mM 上游检测引物2M 下游检测引物2M 检测信号探针2M 上游内控引物1M 下游内控引物

34、1M 内控信号探针1M 反应液内包含的引物与探针的序列信息如下 ： 检测正向引物 ： 5 - AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACACA -3 ； 检测反向引物 ： 5 - CTTTCTAGTAACTCAGCAGCATC -3 ； 检测荧光探针 ： 5 FAM- TCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCT -3 Dabcyl; 内控正向引物 ： 5 -CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3 ； 内控反向引物 ： 5 -CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3 ； 内控荧光探针 ： 5 ROX-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3 BHQ-2

35、。 0038 实施例 4 ： 检测 BRAF 基因 V600E 突变的荧光 PCR 方法 第一步 ： 准备 DNA （1） 、 从待检测者体内采集组织样本 ； （2） 、 从组织样本中获取 DNA， 推荐使用商业化的试剂盒提取 DNA ； （3） 、 测定 DNA 浓度和纯度， 要求浓度 10100ng/l ； OD260nm/OD280nm=1.62.0。 0039 第二步 ： PCR 反应体系配制 在荧光定量 PCR 专用的管子内按照下表配制 PCR 反应体系 表 2.PCR 反应体系组成 ddH2O加至 25l PCR 反应液2.5l DNA 聚合酶 （2.5U/l）0.2l 基因组 D

36、NA约 80ng 石蜡油20l 上述 PCR 反应液采用实施例 3 制备的试剂盒， 也可以按照实施例 3 提供的配方表 1 制 备检测 BRAF 基因 V600E 突变的 PCR 反应液。 0040 第三步 ： 上机检测 说 明 书 CN 102816851 A 8 7/7 页 9 按照下表设置温度循环及信号采集程序 表 3.PCR 反应程序 注 ：“*” 处设置 Fam 和 Rox 双通道采集荧光信号。 0041 第四步 ： 分析结果 在上述 PCR 反应体系与温度循环程序条件下， 在内控信号形成正常对数扩增 “S” 型曲 线的前提条件下， 观察突变检测 PCR 反应体系内目的检测荧光信号是

37、否形成对数扩增 “S” 型曲线， 如果形成对数扩增 “S” 型曲线则该待检样本中含有 BRAF 基因 V600E 突变。 0042 附图 1 为某肿瘤组织样本 BRAF 基因 V600E 突变检测图， 检测图显示内控荧光信号 （ROX 通道） 形成指数扩增 “S” 型曲线， 显示反应体系工作正常， 检测荧光信号 （FAM 通道） 也 形成指数扩增 “S” 型曲线， 提示该样本含有 BRAF 基因 V600E 突变。 0043 附图 2 为某正常组织样本 BRAF 基因 V600E 突变检测图， 检测图显示内控荧光信号 （ROX 通道） 形成指数扩增 “S” 型曲线， 显示反应体系工作正常， 而

38、检测荧光信号 （FAM 通道） 没有形成指数扩增 “S” 型曲线， 提示该样本不含有 BRAF 基因 V600E 突变。 0044 注意 ： 上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点， 其目的在于让熟悉此项技术的人士能 够了解本发明的内容并据以实施， 并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神 实质所作的等效变化或修饰， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 102816851 A 9 1/3 页 10 Organization Applicant - Street : 江苏省常熟市高新区湖山路99号常熟国家大学科技园求真楼T2-409 室 City : 常熟市 State

39、 : 江苏省 Country : 中国 PostalCode : 215500 PhoneNumber : 0512-52358499 FaxNumber : EmailAddress : OrganizationName : 苏州旷远生物分子技术有限公司 Application Project - Title : 用于检测 BRAF 基因 V600E 突变的引物、 探针、 试剂盒及方法 AppFileReference : CurrentAppNumber : CurrentFilingDate : 2012-08-01 Sequence - SEQ ID No.1 OrganismName

40、 : 人类 （Homo sapiens） PreSequenceString AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACACA Type : DNA Length : 28 Sequence - SEQ ID No.2 OrganismName : 人类 （Homo sapiens） PreSequenceString CTTTCTAGTAACTCAGCAGCATC Type : DNA 序 列 表 CN 102816851 A 10 2/3 页 11 Length : 23 Sequence - SEQ ID No.3 OrganismName : 人类 （Homo sapiens）

41、 PreSequenceString TCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCT Type : DNA Length : 24 Sequence - SEQ ID No.4 OrganismName : 人类 （Homo sapiens） PreSequenceString CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG Type : DNA Length : 22 Sequence - SEQ ID No.5 OrganismName : 人类 （Homo sapiens） PreSequenceString CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT Type : DNA Length : 24 Sequence - SEQ ID No.6 OrganismName : 人类 （Homo sapiens） PreSequenceString TGTTGCCATCAATGACCCCTTC 序 列 表 CN 102816851 A 11 3/3 页 12 Type : DNA Length : 22 序 列 表 CN 102816851 A 12 1/2 页 13 图 1 说 明 书 附 图 CN 102816851 A 13 2/2 页 14 图 2 说 明 书 附 图 CN 102816851 A 14