一种从基因水平鉴定中国人群体液的组织来源的方法和系统.pdf

1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201310384486.9 (22)申请日 2013.08.29 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 公安部物证鉴定中心 地址 100038 北京市西城区木樨地南里 17 号 (72)发明人 王冲 李万水 胡兰 徐秀兰 石屹 凃政 (74)专利代理机构 北京同立钧成知识产权代理 有限公司 11205 代理人 黄健 (54) 发明名称 一种从基因水平鉴定中国人群体液的组织来 源的方法和系统 (57) 摘要 本发明提供一种从基因水平鉴定中国人群体 液的组织来源的方法和系统。所述方法包括检 测体液中 GYPA、 SPTB、

2、MMP-7、 STATH、 MUC4、 PRM2 和 TGM4 七个基因的表达状况， 所述体液包括外周 血、 月经血、 唾液、 阴道分泌物和精液中的一种或 多种。本发明还提供了一种从基因水平鉴定中国 人群体液组织来源的系统。本发明提供的方案能 有效从基因水平确定中国人群体液的组织来源， 大大简化了鉴定刑侦现场体液或其斑迹的组织来 源的步骤， 能为明确案件性质、 确定犯罪嫌疑人、 以及定罪量刑等提供准确的科学依据。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书11页 序列表4页 附图6页 (10)申请公布号 CN 104419753

3、A (43)申请公布日 2015.03.18 CN 104419753 A 1/2 页 2 1. 一种从基因水平鉴定中国人群体液组织来源的方法， 所述方法包括 ： 检测体液中 GYPA、 SPTB、 MMP-7、 STATH、 MUC4、 PRM2 和 TGM4 七个基因的表达状况， 所述 体液包括外周血、 月经血、 唾液、 阴道分泌物和精液中的一种或多种， 具有 GYPA 和 / 或 SPTB 基因表达的体液为含有外周血的体液 ； 具有 GYPA 和 SPTB 基因 中的至少一种表达， 并同时存在MMP-7基因表达的体液为含有月经血的体液 ； 具有STATH基 因表达的体液为含有唾液的体液

4、； 具有 MUC4 基因表达的体液为含有阴道分泌物的体液 ； 具 有 PRM2 和 / 或 TGM4 基因表达的体液为含有精液的体液。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 包括 ： 从待检测体液中提取 RNA ； 将提取的 RNA 反转录为 cDNA ； 使用针对所述七个基因的 PCR 扩增引物组对上述 cDNA 进行扩增 , 得到扩增后的 PCR 产物 ； 检测该 PCR 产物中所述七个基因的扩增产物是否存在。 3. 根据权利要求 2 所述的方法， 所述 PCR 扩增引物组由与所述七个基因一一对应的七 对扩增引物组成， 所述扩增引物为序列表中 SEQ ID No.1 至 SEQ ID No

5、.14 的核苷酸序列。 4. 根据权利要求 2 或 3 所述的方法， 通过测序检测该 PCR 产物中所述七个基因的扩增 产物是否存在。 5.根据权利要求3所述的方法， 所述PCR扩增引物组为具有荧光的PCR扩增引物组， 通 过遗传分析仪确定该 PCR 产物中所述七个基因的扩增产物是否存在。 6. 一种从基因水平鉴定中国人群体液组织来源的系统， 所述系统用于检测体液中 GYPA、 SPTB、 MMP-7、 STATH、 MUC4、 PRM2 和 TGM4 七个基因的表达状况， 所述体液包括外周血、 月经血、 唾液、 阴道分泌物和精液中的一种或多种， 具有 GYPA 和 / 或 SPTB 基因表达

6、的体液 为含有外周血的体液 ； 具有GYPA和SPTB基因中的至少一种表达， 并同时存在MMP-7基因表 达的体液为含有月经血的体液 ； 具有 STATH 基因表达的体液为含有唾液的体液 ； 具有 MUC4 基因表达的体液为含有阴道分泌物的体液 ； 具有 PRM2 和 / 或 TGM4 基因表达的体液为含有 精液的体液。 7. 根据权利要求 6 所述的系统， 包括 RNA 提取体系， 反转录体系， PCR 扩增体系和检测 扩增产物体系， 所述 RNA 提取体系用于从待检测体液中提取 RNA ； 所述反转录体系用于将提取的 RNA 反转录为 cDNA ； 所述 PCR 扩增体系用于对上述 cDN

7、A 针对 GYPA、 SPTB、 MMP-7、 STATH、 MUC4、 PRM2 和 TGM4 七个基因进行扩增， 获得扩增产物 ； 所述检测扩增产物体系用于检测所述扩增产物中是否存在所述七个基因的扩增产物。 8. 根据权利要求 7 所述的系统， 所述 PCR 扩增引物组由与所述七个基因一一对应的七 对扩增引物组成， 所述扩增引物为序列表中 SEQ ID No.1 至 SEQ ID No.14 的核苷酸序列。 9. 根据权利要求 7 或 8 所述的系统， 所述检测扩增产物体系通过测序检测所述扩增产 物中是否存在所述七个基因的扩增产物。 10. 根据权利要求 7 所述的系统， 所述 PCR 扩

8、增引物组为具有荧光的 PCR 扩增引物组， 所述检测扩增产物体系通过遗传分析仪确定所述扩增产物中是否存在所述七个基因的扩 权 利 要 求 书 CN 104419753 A 2 2/2 页 3 增产物。 权 利 要 求 书 CN 104419753 A 3 1/11 页 4 一种从基因水平鉴定中国人群体液的组织来源的方法和系 统 技术领域 0001 本发明涉及一种人群体液组织来源的方法和系统， 尤其涉及一种从基因水平鉴定 中国人群体液组织来源的方法和系统。 背景技术 0002 我国法医 DNA 领域经过近三十年的发展， 取得了包括国产化 DNA 试剂在内的大量 的研究成果， 相关技术已成为公安办

9、案实践中的重要科技支撑。犯罪现场遗留体液 ( 包括 外周血、 月经血、 唾液、 阴道分泌物和精液等 ) 及其斑迹或痕迹的检测与鉴定是法医鉴定中 的重要环节。 0003 鉴定体液的组织来源可以为现场重现提供决定性的证据， 可以确定案件性质， 进 而为破案提供关键线索。目前针对上述体液或其斑迹主要通过一系列的生化、 血清学或者 免疫学手段来确定体液或其斑迹的组织来源， 过程复杂、 繁琐， 并且对于刑事案件现场通常 会出现的微量体液检材往往不能获得良好的检测结果。对于这些微量体液检材， 通常会忽 略甚至省略确定其组织来源的步骤， 直接采用 DNA 分析， 将检材 DNA 与已知的 DNA 样本进行

10、比对分析， 从而确定或者排除嫌疑人， 但是在很多案件中体液斑迹的组织来源鉴定仍旧十 分重要， 而且是必不可少的， 例如 ： 在某些刑事案件中， 我们需确认现场某些血迹是属于机 械伤害等造成的损伤性出血， 还是女性正常的生理性出血 （月经期间） ； 而在某些性侵害案 件中， 需要对声称受害的女性提供的血痕或其阴道的出血加以辨别， 以明确该血痕是属于 性侵害造成的损伤性出血还是属于女性正常的生理性出血 （月经期间） ； 以及犯罪现场中存 在的多种体液或其斑迹混合出现的情况， 例如月经血与外周血， 阴道分泌物与唾液， 月经血 与精液等混合出现的情况， 如何有效的区分这些混合体液中含有的体液的组织来源

11、， 成为 明确案件性质、 确定犯罪嫌疑人、 以及定罪量刑等的重要依据。 0004 因此， 国内外研究者在针对从基因水平确定体液或其斑迹的组织来源方面进行了 大量的研究， 但是国内目前还没有报道显示可以同时对上述外周血、 月经血、 唾液、 阴道分 泌物和精液进行准确快速的鉴定， 国外虽然报道了针对多种体液的鉴定方法， 并且开始尝 试法医学应用， 但是在利用其鉴定方法对中国人群中上述体液进行鉴定时， 往往无法获得 结果， 或者获得与实际情况相反的结果， 考虑出现这些状况的可能原因是由于不同地域人 种之间体液所含有的特异性基因不同， 以及这些特异性基因的表达丰度不同， 国外的研究 结果难以直接应用于

12、针对中国人群的体液组织来源的鉴定。 0005 因此， 如何针对中国人群开发一种方法或系统， 可同时对未知组织来源的体液进 行上述多种体液的组织来源的鉴定， 成为有待解决的问题。 发明内容 0006 本发明提供一种从基因水平鉴定中国人群体液的组织来源的方法， 所述方法能通 过确定待检测体液中特定基因的表达状况来确定该体液的组织来源， 为明确案件性质、 确 说 明 书 CN 104419753 A 4 2/11 页 5 定犯罪嫌疑人、 以及定罪量刑等提供准确的科学依据。 0007 本发明还提供了一种从基因水平鉴定中国人群体液的组织来源的系统， 所述系统 通过 RNA 提取体系， 反转录体系， PC

13、R 扩增体系和检测扩增产物体系确定待检测体液中特定 基因的表达状况， 进而确定该体液的组织来源， 为现场重现， 确定案件性质， 以及破案提供 关键线索。 0008 本发明提供的一种从基因水平鉴定中国人群体液组织来源的方法， 所述方法包括 检测体液中 GYPA、 SPTB、 MMP-7、 STATH、 MUC4、 PRM2 和 TGM4 七个基因的表达状况， 所述体液 包括外周血、 月经血、 唾液、 阴道分泌物和精液中的一种或多种， 具有 GYPA 和 / 或 SPTB 基因 表达的体液为含有外周血的体液 ； 具有 GYPA 和 SPTB 基因中的至少一种表达， 并同时存在 MMP-7 基因表达

14、的体液为含有月经血的体液 ； 具有 STATH 基因表达的体液为含有唾液的体 液 ； 具有 MUC4 基因表达的体液为含有阴道分泌物的体液 ； 具有 PRM2 和 / 或 TGM4 基因表达 的体液为含有精液的体液。 0009 进一步的， 所述方法包括 ： 从待检测体液中提取 RNA ； 将提取的 RNA 反转录为 cDNA ； 使用针对所述七个基因的 PCR 扩增引物组对上述 cDNA 进行扩增 , 得到扩增后的 PCR 产物 ； 检测该 PCR 产物中所述七个基因的扩增产物是否存在。 0010 更进一步的， 所述 PCR 扩增引物组由与所述七个基因一一对应的七对扩增引物组 成， 所述扩增引

15、物为序列表中 SEQ ID No.1 至 SEQ ID No.14 的核苷酸序列。 0011 更进一步的， 通过测序检测该 PCR 产物中所述七个基因的扩增产物是否存在。 0012 在本发明的一个实施方式中， 所述 PCR 扩增引物组为具有荧光的 PCR 扩增引物 组， 通过遗传分析仪确定该 PCR 产物中所述七个基因的扩增产物是否存在。在本发明的 方案中， 所述遗传分析仪可以是本领域技术人员常规使用的遗传分析仪， 例如 ABI3130 或 ABI3500 型遗传分析仪， 通过ID-X1.2软件或其他GeneMapper软件等分析 该 PCR 产物中所述七个基因的扩增产物是否存在。在本发明的实

16、施方式中， 将实际扩增出 的产物长度、 产物颜色与表 2 中记载的引物要扩增的长度、 产物颜色进行比对， 实际扩增出 的产物长度只要与表 2 记载的扩增长度相等或相近即可， 二者可以存在偏差， 只要在本领 域技术人员可以接受的范围内即可， 或者通过测序确认是所要扩增的片段即可。 0013 在本发明的方案中， 所述体液包括外周血、 月经血、 唾液、 阴道分泌物和精液中的 一种或多种。当然本发明的体液还可以是上述 5 种体液中的一种或多种在体外干燥后形成 的斑迹。 0014 由于刑事案件现场存在的各种体液的斑迹中RNA的含量往往是pg级的， 而该量不 能满足先进行定量， 后进行组织来源分析的需要，

17、 因此实际操作中是要将从斑迹提取的全 部RNA直接用于进行组织来源分析， 在本申请的方案中， 各种体液样本RNA的量仅通过体积 来表示， 这对本领域技术人员来说是可以理解的， 并且能够实施本申请的方案。 在本发明的 一个具体实施方式中， 上述 5 种体液被制成类似于刑事案件现场出现的体液样本， 以获得 更符合实际情况的结果。在本发明的具体实施方式中， 所述 5 种体液可以是单独存在， 也可 以是混合存在的 ( 例如， 液态的体液样本按照 1 ： 1 ： 1 ： 1 ： 1 的体积比混合存在， 或者体液斑 迹样本的 RNA 按照 1 ： 1 ： 1 ： 1 ： 1 的体积比混合存在， 或者由 R

18、NA 反转录获得的 cDNA 按照 1 ： 1 ： 1 ： 1 ： 1 的体积比混合存在 )。 0015 在本发明的方案中， 所述外周血为被造血器官释放入循环系统参与循环的血， 它 说 明 书 CN 104419753 A 5 3/11 页 6 区别于造血器官内的未成熟的血细胞或未被释放入循环的血细胞。 0016 月经血本质上是子宫内膜变形、 坏死、 脱落， 混合内膜小血管的破裂出血， 除了含 有子宫内膜外， 还含有血细胞等。 0017 唾液是唾液腺的分泌物。 0018 阴道分泌物是由阴道粘膜渗出物、 前庭腺、 宫颈腺、 子宫内膜等的分泌液与脱落上 皮细胞、 阴道正常菌群及其代谢产物组成的混合

19、物。 0019 精液主要由精子及精浆组成， 是一种含蛋白质、 各种酶及果糖等多种成分的碱性 乳白色胶状液体。 0020 本发明提供的一种从基因水平鉴定中国人群体液组织来源的系统， 所述系统用于 检测体液中 GYPA、 SPTB、 MMP-7、 STATH、 MUC4、 PRM2 和 TGM4 七个基因的表达状况， 所述体液 包括外周血、 月经血、 唾液、 阴道分泌物和精液中的一种或多种， 具有 GYPA 和 / 或 SPTB 基因 表达的体液为含有外周血的体液 ； 具有 GYPA 和 SPTB 基因中的至少一种表达， 并同时存在 MMP-7 基因表达的体液为含有月经血的体液 ； 具有 STAT

20、H 基因表达的体液为含有唾液的体 液 ； 具有 MUC4 基因表达的体液为含有阴道分泌物的体液 ； 具有 PRM2 和 / 或 TGM4 基因表达 的体液为含有精液的体液。 0021 进一步的， 所述系统包括 RNA 提取体系， 反转录体系， PCR 扩增体系和检测扩增产 物体系， 0022 所述 RNA 提取体系用于从待检测体液中提取 RNA ； 0023 所述反转录体系用于将提取的 RNA 反转录为 cDNA ； 0024 所述 PCR 扩增体系用于对上述 cDNA 针对 GYPA、 SPTB、 MMP-7、 STATH、 MUC4、 PRM2 和 TGM4 七个基因进行扩增， 获得扩增产

21、物 ； 0025 所述检测扩增产物体系用于检测所述扩增产物中是否存在所述七个基因的扩增 产物。 0026 更进一步的， 所述 PCR 扩增引物组由与所述七个基因一一对应的七对扩增引物组 成， 所述扩增引物为序列表中 SEQ ID No.1 至 SEQ ID No.14 的核苷酸序列。 0027 更进一步的， 所述检测扩增产物体系通过测序检测所述扩增产物中是否存在所述 七个基因的扩增产物。 0028 在本发明的另一个具体实施方式中， 所述 PCR 扩增引物组为具有荧光的 PCR 扩增 引物组， 所述检测扩增产物体系通过遗传分析仪确定所述扩增产物中是否存在所述七个基 因的扩增产物。 0029 在本

22、发明的方案中， 所述七个基因信息如表 1 所示 ： 0030 表 1 0031 序号基因染色体位置 1GYPA4q31.21 2SPTB14q23-q24.2 说 明 书 CN 104419753 A 6 4/11 页 7 3MMP-711q21-q22 4STATH4q13.3 5MUC43q29 6PRM216p13.2 7TGM43p22-p21.33 0032 上述七个基因是申请人经过大量实验和生物信息学分析筛选出在中国人群的体 液包括外周血、 月经血、 唾液、 阴道分泌物和精液中的一种或多种中存在的复合扩增效率 好、 特异性较高的七个基因。 0033 本发明提供的 7 对扩增引物及其

23、相对应的基因如表 2 所示， PCRU 代表上游引物， PCRL 代表下游引物 ； 0034 表 2 0035 0036 本发明方案中的具有荧光的 PCR 扩增引物组如表 3 所示。 0037 表 3 0038 0039 说 明 书 CN 104419753 A 7 5/11 页 8 0040 本发明方案具有以下优点 ： 0041 1、 通过本发明的方法和系统， 可以同时进行包括外周血、 月经血、 唾液、 阴道分泌 物、 精液等体液或其斑迹组织来源的鉴定， 可实现形态学相似的多种体液混合的复杂斑迹 的鉴定， 实现样本的高效利用 ； 0042 2、 本发明的方法可以实现上述斑迹中的一种、 两种，

24、 或两种以上混合物的组织来 源的鉴定。 0043 3、 克服了现有的血液及其斑迹来源的检测方法通常利用抗人血红蛋白抗体与血 红蛋白的交叉反应形成复合物来检测， 容易受温度、 PH、 以及血液质量等的影响， 检测结果 极易出现假阳性或假阴性的缺陷。 以及现有的检测手段无法实现对外周血和月经血区分的 缺陷。 0044 3、 克服了现有技术中检测唾液斑主要依赖于检测是否存在淀粉酶， 而人体其他体 液如鼻涕、 尿液、 精液中也含少量淀粉酶， 因此仅依靠测出斑迹中有淀粉酶， 不能确证唾液， 由此使得唾液斑迹检材不能得到有效的利用的问题。 0045 4、 通过荧光标记， 利用常规的遗传分析仪， 根据所要扩

25、增的基因的分子量和荧光 颜色的不同， 获得直观的检测结果， 并且该结果经过测序验证， 准确性为 100%。 0046 5、 本发明提供的方案能有效从基因水平确定中国人群体液的组织来源， 大大简化 了鉴定刑侦现场体液或其斑迹的组织来源的步骤， 能为明确案件性质、 确定犯罪嫌疑人、 以 及定罪量刑等提供准确的科学依据。 附图说明 0047 图 1 为 5 种体液样本混合存在时的检测结果。 0048 图 2 为外周血样本单独存在时的检测结果。 0049 图 3 为月经血样本单独存在时的检测结果。 0050 图 4 为唾液样本单独存在时的检测结果。 0051 图 5 为阴道分泌物样本单独存在时的检测结

26、果。 0052 图 6 为精液样本单独存在时的检测结果。 具体实施方式 0053 本发明实施例中使用的样本来自北京及山东地区的 150 名志愿者。本申请为模拟 刑事案件现场出现的外周血、 月经血、 唾液、 阴道分泌物和精液样本， 分别将采集的上述体 说 明 书 CN 104419753 A 8 6/11 页 9 液样本制作为类似于刑事案件现场出现的体液样本， 简称模拟体液样本， 使用本发明的方 法进行检测， 以获得更符合实际情况的结果。本实施例采用的模拟体液样本中 ： 0054 模拟外周血斑迹 ( 也称外周血痕 ) 样本可通过采集志愿者指尖血， 将 50l 指尖 血滴到纱布上， 室温晾干获得。

27、 0055 模拟月经血斑迹为 ( 也称月经血痕 ) 志愿者用无菌棉签在月经 2-3 天时采集， 室 温晾干获得。 0056 模拟唾液斑迹可通过将志愿者唾液收集在离心管中， 取 50l 滴到纱布上， 室温 晾干获得。 0057 模拟精液斑迹可通过将新鲜精液收集在塑料杯中， 取 50l 滴到纱布或棉签上， 室温晾干获得。 0058 模拟阴道分泌物斑迹可由专业医生采集阴道分泌物后， 室温晾干获得。 0059 模拟体液样本样本个数 模拟外周血痕样本30 模拟月经血痕样本30 模拟唾液斑迹样本30 模拟精液斑迹样本30 模拟阴道分泌物斑迹样本30 0060 所用方法如无特别说明均为常规方法， 所用试剂耗

28、材和仪器如下表所示 ： 说 明 书 CN 104419753 A 9 7/11 页 10 0061 0062 实施例 1、 验证本发明的系统和方法的准确性 0063 本实施例将上述 5 种模拟体液样本在单独存在， 以及混合存在的情况下， 分别使 用本发明的方法和系统进行检测。 0064 本发明的从基因水平鉴定中国人群体液组织来源的系统， 包括 RNA 提取体系， 反转录体系， PCR 扩增体系和检测扩增产物体系。所述系统用于检测体液中 GYPA、 SPTB、 MMP-7、 STATH、 MUC4、 PRM2 和 TGM4 七个基因的表达状况， 所述体液包括外周血、 月经血、 唾 液、 阴道分泌

29、物和精液中的一种或多种， 具有 GYPA 和 / 或 SPTB 基因表达的体液为含有外周 血的体液 ； 具有GYPA和SPTB基因中的至少一种表达， 并同时存在MMP-7基因表达的体液为 含有月经血的体液 ； 具有 STATH 基因表达的体液为含有唾液的体液 ； 具有 MUC4 基因表达的 体液为含有阴道分泌物的体液 ； 具有PRM2和/或TGM4基因表达的体液为含有精液的体液。 0065 1、 利用所述系统中的 RNA 提取体系从待检测体液中提取 RNA， 包括 ： 按照 RNeasy Micro Kit 说明书操作， 0066 1） 将含有 5 种体液的斑迹样本或痕迹样本的约 2x2cm2

30、纱布或者棉签头部分别 置于 1.5ml 离心管中， 充分剪碎后加入 350l RLT 缓冲液， 充分浸透， 将其置于 56孵育 30min ； 0067 2） 将离心管中液体吸出， 置于新离心管， 于其中加入同等体积 （350l） 的 70% 乙 醇， 混匀 ； 0068 3） 将上述液体转移至置有 RNeasy MinElute spin column 的 2ml 收集管， 关闭盖 子， 10,000rpm 离心 15s， 倾掉废液 ； 0069 4） 在置有 RNeasy MinElute spin column 的 2ml 收集管加入 350l RW1， 轻轻关 闭盖子， 10,000r

31、pm 离心 15s， 倾掉废液 ； 说 明 书 CN 104419753 A 10 8/11 页 11 0070 5） 取一离心管， 加入 70l RDD， 后再加入 10l DNase I stock solution， 充分 混匀 ； 0071 6） 将上述混合液 （80l） 滴加至 RNeasy MinElute spin column 膜上， 20-30孵 育 15m ； 0072 7） 在置有 RNeasy MinElute spin column 的 2ml 收集管加入 350l RW1， 轻轻关 闭盖子， 10,000rpm 离心 15s， 倾掉废液和收集管 ； 0073 8）

32、将 RNeasy MinElute spin column 放入新的 2ml 收集管中， 加入 500lBuffer RPE。轻轻关闭盖子， 10,000rpm 离心 15s 清洗柱膜， 倾掉废液 ； 0074 9） 在置有 RNeasy MinElute spin column 的 2ml 收集管加入 500l80% 乙醇， 轻 轻关闭盖子， 10,000rpm 离心 2m， 倾掉废液和收集管 ； 0075 10） 将 RNeasy MinElute spin column 放入新的 2ml 收集管中， 打开管盖， 全速离 心 5m， 倾掉废液和收集管 ； 0076 11）将 RNeasy

33、MinElute spin column 放入新的 1.5ml 离心管中， 加入 14l RNase-free water， 轻轻关闭盖子， 全速离心 1m， 获得 RNA(5 种体液样本的 RNA 单独存在 )。 0077 2、 利用所述系统中的反转录体系将提取的 RNA 反转录为 cDNA(5 种模拟体液样 本的 cDNA 单独存在 )， 包括按照 SuperScriptTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR 说明书操作。 0078 1） 将以下成分离心， 混匀 ； 0079 模板 RNA8l Random hexamers(50ng/l)1

34、l dNTP mix（各 10mM）1l 0080 2） 65孵育 5m， 置于冰上至少 1m ； 0081 3） 制备包含下述成分的混合液 ； 0082 10RT buffer2l MgCl2(25mM)4l DTT(0.1M)2l RNaseOUTTM(40U/l)1l SuperScriptTM RT(200U/l)1l 0083 4） 将上述两个混合液混合， 25孵育 10m， 50孵育 50m ； 0084 5)85 5m 终止反应， 冰上降温 ； 0085 6) 加入 1l RNase H， 37孵育 20m， -20保存备用。 0086 3、 利用所述系统中的 PCR 扩增体系对

35、 cDNA(5 种体液样本的 cDNA 单独存在， 以及 说 明 书 CN 104419753 A 11 9/11 页 12 5 种体液样本的 cDNA 以 1 ： 1 ： 1 ： 1 ： 1 的体积比混合存在 ) 针对 GYPA、 SPTB、 MMP-7、 STATH、 MUC4、 PRM2 和 TGM4 七个基因进行扩增， 使用表 3 所示的荧光 PCR 扩增引物组， 扩增体系如 表 4 所示 ： 0087 表 4 0088 0089 0090 扩增程序为 ： 9515min， 9420s、 6030s、 7240s40个循环， 72延伸10min， 4保存， 获得 PCR 扩增产物。 0

36、091 4、 利用所述系统中的检测扩增产物体系检测该 PCR 产物中所述七个基因的扩增 说 明 书 CN 104419753 A 12 10/11 页 13 产物是否存在。 0092 在实施例中将PCR扩增获得的产物通过ABI3130/3500型遗传分析仪上进行检测， ID-X1.2 软件根据所要扩增的基因的分子量和荧光颜色的不同分析所述 七个基因的扩增产物是否存在。5 种模拟体液样本在混合存在的情况下获得的结果如图 1 所示。5 种模拟体液样本在单独存在的情况下获得的结果如图 2-6 所示。在上述图 1-6 中， 下面标注有黑色方框的峰为有效峰， 方框中数字代表扩增产物的长度， 峰的高度代表

37、产物 的丰度， 峰的颜色为荧光经激发后产生的颜色， 其中， 绿色的峰代表经 HEX 染料标记的扩增 产物， 蓝色的峰代表经FAM染料标记的扩增产物， 黑色的峰代表经TAMRA染料标记的扩增产 物。 在不同的分析仪中， 荧光染料经激发后产生的光可能与其本身带有的颜色不同， 这对本 领域技术人员来说是可以理解的。在图 1-6 中， 从上到下的三组峰 ( 横向看 ) 分别呈蓝色、 绿色、 黑色。 0093 图 1 可以看出， 将外周血、 月经血、 唾液、 阴道分泌物、 精液 cDNA 各 0.6l 按照 1 ： 1 ： 1 ： 1 ： 1 的体积比混合后作为表 4 中的 cDNA 模板进行 PCR

38、扩增， 结果显示， 血液特异性 GYPA、 SPTB， 月经血特异性 MMP-7、 唾液特异性 STATH、 阴道分泌物特异性 MUC4、 精液特异性 PRM2、 TGM4 均检测到有表达。 0094 图 2 可以看出， 当使用 3l 外周血 cDNA 作为表 4 中的 cDNA 模板时 PCR 扩增结果 中， 血液特异性 GYPA、 SPTB 检测到有表达， 月经血特异性 MMP-7， 唾液特异性 STATH， 阴道分 泌物特异性 MUC4， 精液特异性 PRM2、 TGM4 均未检测到表达。 0095 图 3 可以看出， 当使用 3l 月经血 cDNA 作为表 4 中的 cDNA 模板时

39、PCR 扩增结果 中， 血液特异性 GYPA、 SPTB， 月经血特异性 MMP-7 检测到有表达， 唾液特异性 STATH， 阴道分 泌物特异性 MUC4， 精液特异性 PRM2、 TGM4 均未检测到表达。 0096 图4可以看出， 当使用3l唾液cDNA作为表4中的cDNA模板时PCR扩增结果中， 唾液特异性STATH检测到有表达， 血液特异性GYPA、 SPTB， 月经血特异性MMP-7， 阴道分泌物 特异性 MUC4， 精液特异性 PRM2、 TGM4 均未检测到表达。 0097 图5可以看出， 当使用3l阴道分泌物cDNA作为表4中的cDNA模板时PCR扩增结 果中， 阴道分泌物特

40、异性MUC4检测到有表达， 血液特异性GYPA、 SPTB， 月经血特异性MMP-7， 唾液特异性 STATH， 精液特异性 PRM2、 TGM4 均未检测到表达。 0098 图 6 可以看出， 当使用 3l 精液 cDNA 作为表 4 中的 cDNA 模板时 PCR 扩增结果 中， 精液特异性 PRM2、 TGM4 检测到有表达， 血液特异性 GYPA、 SPTB， 月经血特异性 MMP-7， 唾 液特异性 STATH， 阴道分泌物特异性 MUC4， 均未检测到表达。 0099 5、 为了验证上述结果的准确性， 将以上 5 种模拟体液样本使用表 2 中没有荧光的 引物进行扩增， 分析上述 5

41、 种模拟体液样本在单独存在， 或混合存在情况下的 PCR 产物， 通 过测序分析是否存在 GYPA、 SPTB、 MMP-7、 STATH、 MUC4、 PRM2 和 TGM4 七个基因的扩增产物， 测序结果与上述采用遗传分析仪结果一致性达到 100， 如下所示 ： 0100 说 明 书 CN 104419753 A 13 11/11 页 14 0101 此结果证实本发明的系统和方法在分析外周血、 月经血、 唾液、 阴道分泌物和精液 中的一种或多种的组织来源结果准确， 能够为明确案件性质、 确定犯罪嫌疑人、 以及定罪量 刑等提供准确的科学依据。 说 明 书 CN 104419753 A 14

42、1/4 页 15 0001 0002 序 列 表 CN 104419753 A 15 2/4 页 16 0003 序 列 表 CN 104419753 A 16 3/4 页 17 0004 序 列 表 CN 104419753 A 17 4/4 页 18 序 列 表 CN 104419753 A 18 1/6 页 19 图 1 说 明 书 附 图 CN 104419753 A 19 2/6 页 20 图 2 说 明 书 附 图 CN 104419753 A 20 3/6 页 21 图 3 说 明 书 附 图 CN 104419753 A 21 4/6 页 22 图 4 说 明 书 附 图 CN 104419753 A 22 5/6 页 23 图 5 说 明 书 附 图 CN 104419753 A 23 6/6 页 24 图 6 说 明 书 附 图 CN 104419753 A 24