抗乙型肝炎病毒X蛋白多肽药物.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102675423 A (43)申请公布日 2012.09.19 CN 102675423 A *CN102675423A* (21)申请号 201110061855.1 (22)申请日 2011.03.15 C07K 7/08(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) A61K 38/10(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 1/

2、16(2006.01) A61P 31/20(2006.01) (71)申请人 天津托普泰克生物科技有限公司 地址 300457 天津市开发区洞庭路 220 号天 津市国际生物医药联合研究院实验楼 S1005 (72)发明人 张晓东 叶丽虹 (74)专利代理机构 中原信达知识产权代理有限 责任公司 11219 代理人 杨青 樊卫民 (54) 发明名称 抗乙型肝炎病毒 X 蛋白多肽药物 (57) 摘要 本发明涉及多肽药物领域， 具体涉及抗乙型 肝炎病毒 X 蛋白的多肽和编码此多肽的多核苷 酸， 以及它们的应用。具体来说， 本发明涉及一 种具有抑制乙型肝炎病毒 X 蛋白 (hepatitis B

3、virus X protein， HBx) 功能活性的多肽， 其在分 子水平、 细胞水平和动物水平上具有抑制 HBx 的 活性， 因而能抑制乙型肝炎病毒感染所造成的肝 炎， 由肝炎反复发作引起的肝硬变， 以及在肝硬变 基础上发生的肝癌。 该多肽和它的肽模拟物， 包括 它们的功能片段和功能变体， 以及编码这些多肽、 肽模拟物或它们的功能片段、 功能变体的基因， 可 广泛用于防治乙型肝炎感染后的肝病， 包括肝炎、 肝硬变和肝癌。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 23 页 序列表 4 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页

4、 说明书 23 页 序列表 4 页 附图 5 页 1/1 页 2 1. 分离的多肽或肽模拟物， 其包含如 SEQ ID NO ： 1 所示的氨基酸序列、 或其功能片段 或功能变体， 所述多肽或肽模拟物具有抑制乙型肝炎病毒 X 蛋白的功能， 并能抑制乙型肝 炎病毒感染后的慢性肝病的发生和发展。 2. 权利要求 1 所述的多肽或肽模拟物， 所述乙肝病毒感染后的慢性肝病包括肝炎、 肝 硬变和肝癌。 3. 权利要求 1 所述的多肽或肽模拟物， 其包含的氨基酸序列、 其功能片段或功能变体 具有与 SEQ ID NO ： 1 所示的氨基酸序列至少 70的相同性。 4. 权利要求 1 所述的多肽或肽模拟物，

5、 其包含的氨基酸序列、 其功能片段或功能变体 具有与 SEQ ID NO ： 1 所示的氨基酸序列至少 80的相同性。 5. 权利要求 1 所述的多肽或肽模拟物， 其包含的氨基酸序列、 其功能片段或功能变体 具有与 SEQ ID NO ： 1 所示的氨基酸序列至少 90的相同性。 6. 权利要求 1 所述的多肽或肽模拟物， 其包含如 SEQ ID NOs ： 1-6 中所示的任一种氨 基酸序列。 7. 分离的多核苷酸， 所述多核苷酸包含选自下组中的一种 ： a) 编码 SEQ ID NO ： 1 所示的氨基酸序列、 其功能片段或功能变体的多核苷酸 ； 或者 b) 与多核苷酸 a) 互补或严格杂

6、交的多核苷酸。 8. 权利要求 7 的多核苷酸， 所述多核苷酸包含选自下组中的一种 ： a) 编码 SEQ ID NOs ： 1-6 所示的任一种氨基酸序列的多核苷酸 ； 或者 b) 与多核苷酸 a) 互补或严格杂交的多核苷酸。 9. 重组表达载体， 其包含权利要求 7 或 8 所述的多核苷酸。 10. 包括如权利要求 9 所述的重组表达载体的宿主细胞。 11. 权利要求 1-6 中任一所述多肽在制造抗乙肝病毒感染后的慢性肝病的药物中的应 用。 12. 权利要求 7-8 中任一所述核苷酸在制造抗乙肝病毒感染后的慢性肝病的药物中的 应用。 13. 权利要求 9 中所述重组表达载体在制造抗乙肝病毒

7、感染后的慢性肝病的药物中的 应用。 14. 权利要求 11-13 中的任一种应用， 所述应用为制造抗乙型肝炎的治疗性疫苗。 15. 药物组合物， 其包含权利要求 1-6 中任一所述的多肽或肽模拟物， 以及任选的药物 载体。 16. 药物组合物， 其包含权利要求 7-8 中任一所述的多核苷酸， 以及任选的药物载体。 17. 药物组合物， 其包含权利要求 9 中所述的重组表达载体， 以及任选的药物载体。 权 利 要 求 书 CN 102675423 A 2 1/23 页 3 抗乙型肝炎病毒 X 蛋白多肽药物 技术领域 0001 本发明涉及多肽药物领域， 具体涉及抗乙型肝炎病毒 X 蛋白的多肽和编码

8、此多肽 的多核苷酸， 以及它们的应用。 背景技术 0002 肝癌是导致病人死亡的恶性肿瘤之一， 其恶性程度高， 在我国肝癌死亡率仅次于 胃癌， 居我国恶性肿瘤死亡率第二位。据统计， 我国每年新增肝癌人数 30 万人， 而每年肝癌 死亡人数达 11 万。乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus， HBV) 感染可导致肝炎、 肝硬变和原 发性肝癌的发生， 在我国 80以上的肝癌患者为乙肝感染后肝癌， 可称之为乙肝后肝癌。 0003 HBV 为长约 3.2Kb 的 DNA 病毒， 其开放阅读框表达乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)、 乙型肝炎病毒核心抗原 (HBcAg)、 乙型肝炎病毒多

9、聚酶和乙型肝炎病毒 X 抗原 (HBxAg)( 或称之为乙型肝炎病毒 X 蛋白， 即 HBx)， 其中 HBx 是 HBV DNA 复制所必须的因子。 由于 HBx 是 HBV DNA 复制所必须的因子， 因此抑制 HBx 的功能， 意味着可抑制 HBV 的感染， 以及由此导致的肝炎和肝硬变。 0004 另外， HBx 作为反式作用因子， 促进肝癌的生长和增殖， 称之为癌蛋白。在分子水 平、 细胞水平和动物水平的研究也发现， HBx 具有很强的促肝癌细胞增殖和迁移的作用。转 基因鼠实验也证明 HBx 具有显著的促进肝癌发生的作用。大量研究结果显示， HBV 感染的 持续存在可导致慢性肝病， 包

10、括慢性肝炎、 慢性肝炎反复发作引起的肝组织中纤维结缔组 织增生后发生的肝硬变， 及大部分在肝硬变基础上发生的肝癌。在慢性肝病 ( 包括肝炎、 肝 硬变和肝癌 ) 的发生发展过程中， HBx 发挥了重要的作用。因此， HBx 是预防和治疗肝病的 重要靶点。 0005 目前， 肝癌的治疗以手术为主， 辅以介入疗法， 而化疗效果不理想。在临床手术的 肝癌组织中 HBsAg 和 HBxAg 的表达阳性检出率高达 80甚至 90以上。因此， HBx 作为肝 癌发生发展的重要致病因子， 而发现其特异性抑制剂， 则具有重要的理论意义和实际临床 应用价值。然而， 由于目前 HBx 的三维构象解析尚未完成， 故

11、难以通过 HBx 立体三维构象设 计其化学抑制剂。 0006 多肽片段可作为药物， 其在临床上已广为应用。例如， 胸腺肽 (thymopeptide) 是 从小牛胸腺中提取的胸腺五肽， 具有促进淋巴细胞转化、 增强巨噬细胞吞噬活性的作用， 可 用于治疗多种免疫缺陷病。多肽药物的特点是药理作用明确， 安全性高， 并易于生产。但 是， 多肽药物的发现难度大， 其原因在于大部分的多肽片段在体内的半衰期短， 直接影响药 效学作用。 发明内容 0007 本发明涉及一种具有抑制乙型肝炎病毒 X 蛋白 (hepatitis B virus X protein， HBx) 功能活性的多肽， 其在分子水平、 细

12、胞水平和动物水平上具有抑制 HBx 的活性， 因而能 抑制乙型肝炎病毒感染所造成的肝炎， 由肝炎反复发作引起的肝硬变， 以及在肝硬变基础 说 明 书 CN 102675423 A 3 2/23 页 4 上发生的肝癌。该多肽和它的肽模拟物， 包括它们的功能片段和功能变体， 以及编码这些 多肽、 肽模拟物或它们的功能片段、 功能变体的基因， 可广泛用于防治乙型肝炎感染后的肝 病， 包括肝炎、 肝硬变和肝癌。 0008 一方面， 本发明提供了分离的多肽或肽模拟物， 其包含如SEQ ID NO ： 1所示的氨基 酸序列、 或其功能片段或功能变体， 所述多肽或肽模拟物具有抑制乙型肝炎病毒 X 蛋白的 功

13、能， 并能抑制乙型肝炎病毒感染后的慢性肝病的发生和发展。所述乙肝病毒感染后的慢 性肝病可以包括肝炎， 由肝炎反复发作引起的肝硬变， 以及在肝硬变基础上发生 的肝癌。 0009 在本发明的一些具体实施例中， 上述多肽或肽模拟物， 其包含的氨基酸序列、 其功 能片段或功能变体可以具有与 SEQ ID NO ： 1 所示的氨基酸序列至少 70， 或者 80， 或者 90， 以及甚至更高的相同性。优选地， 这些多肽或肽模拟物包含如 SEQ ID NOs ： 1-6 中所 示的任一种氨基酸序列。 0010 另一方面， 本发明提供分离的多核苷酸， 所述多核苷酸包含编码如SEQ ID NO ： 1所 示的氨

14、基酸序列、 其功能片段或功能变体的多核苷酸 ； 或者是与包含编码如 SEQ ID NO ： 1 所示的氨基酸序列、 其功能片段或功能变体的多核苷酸互补或严格杂交的多核苷酸。优选 地， 这些多核苷酸为编码SEQ ID NOs ： 1-6所示的氨基酸序列的多核苷酸， 或者为与编码SEQ ID NOs ： 1-6 所示的氨基酸序列的多核苷酸互补或严格杂交的多核苷酸。 0011 另一方面， 本发明还提供含有外源多核苷酸的重组表达载体， 其包含编码如 SEQ ID NO ： 1 所示的氨基酸序列、 其功能片段或功能变体的多核苷酸 ； 或者是与包含编码如 SEQ ID NO ： 1 所示的氨基酸序列、 其

15、功能片段或功能变体的多核苷酸互补或严格杂交的多核苷 酸。 优选地， 这些重组表达载体权利包含编码SEQ ID NOs ： 1-6所示的氨基酸序列的多核苷 酸， 或者包含与编码SEQ ID NOs ： 1-6所示的氨基酸序列的多核苷酸互补或严格杂交的多核 苷酸。本方明还提供包括上述重组表达载体的宿主细胞。 0012 此外， 本发明也提供包括上述多肽或肽模拟物、 核苷酸以及重组表达载体在制造 抗乙肝病毒感染后的慢性肝病的药物中的应用。在一个具体实施例中， 所述药物可为乙肝 的治疗性疫苗。所述药物可以包含药物组合物， 其可以包含任选的药物载体。 0013 本发明中， 所述的多肽 ( 包括其功能片段或

16、变体 ) 及其肽模拟物， 作为 HBx 的有效 抑制因子， 具有抑制 HBx 的生物活性的能力， 能抑制乙型肝炎病毒感染所造成的肝炎， 由此 引发的肝硬变和在肝硬变基础上发生的肝癌。值得强调的是， 本发明提供的上述多肽具有 明显的药效学作用， 因此可以成为治疗由于乙肝病毒感染所导致的肝病的有效药物。 附图说明 0014 图 1 ： 应用高压液相色谱 (HPLC) 对纯化后人工合成多肽 Anti-HBxP2# 的分析结 果。 0015 图 2. 应用报告基因检测本发明的多肽基因质粒对表达 HBx 蛋白的肝癌细胞的影 响。结果显示， p-Anti-HBxP2# 对 HepG2-X 细胞、 L-O2

17、-X 细胞和 HepG2.2.15 细胞中 NF-B 启 动子的活性具有抑制作用， 呈剂量依赖性， 而对无 HBx 的 HepG2 肝癌细胞和无 HBx 的 L-O2 肝细胞无影响。相似地， p-Anti-HBxP2# 的 5 种功能变体基因 (0.15g/well) 对 HepG2-X 细胞和 L-O2-X 细胞中 NF-B 启动子的活性具有一定的抑制作用。*P 0.05， *P 0.01， 进 行 Student s t test 统计学分析。 说 明 书 CN 102675423 A 4 3/23 页 5 0016 图 3. 检测本发明的多肽在细胞水平对表达的 HBx 蛋白激活 NF-B

18、 启动子的活性的 影响。结果显示， 人工合成的多肽 Anti-HBxP2# 对表达 HBx 蛋白的 HepG2-X 细胞、 L-O2-X 细 胞和HepG2.2.15细胞中的NF-B启动子的活性具有抑制作用， 且该抑制作用呈剂量依赖性， 但对无 HBx 表达的 HepG2 肝癌细胞和 L-O2 肝细胞则无此影响。*P 0.05， *P 0.01， 进 行 Student s t test 统计学分析。 0017 图 4. 应用 MTT 检测转染本发明的多肽基因质粒对表达 HBx 蛋白的肝癌细胞的影 响。结果显示， p-Anti-HBxP2# 对 HepG2-X 细胞、 L-O2-X 细胞和 H

19、epG2.2.15 细胞生长和 增殖具有抑制作用， 且其效果呈剂量依赖性， 但对无 HBx 表达的 HepG2 肝癌细胞和 L-O2 肝 细胞则无影响。p-Anti-HBxP2# 的 5 种功能变体基因 (0.15g/well) 对 HepG2-X 细胞和 L-O2-X 细胞的生长和增殖也具有抑制作用。p-Anti-HBxP2# 后 *P 0.05， *P 0.01， 进 行 Student s t test 统计学分析。 0018 图 5. 应用 MTT 检测本发明的多肽对肝癌细胞的生长的影响。结果显示， 应用人工 合成的多肽 Anti-HBxP2# 对 HepG2-X 细胞、 L-O2-X

20、 细胞和 HepG2.2.15 细胞生长和增殖具 有抑制作用， 且其作用呈剂量依赖性。而对无 HBx 表达的 HepG2 肝癌细胞和 L-O2 肝细胞无 影响。*P 0.05， *P 0.01， 进行 Student s t test 统计学分析。 0019 图 6 ： 人工合成的多肽 Anti-HBxP2# 对 HepG2-X 细胞的作用。裸鼠接种实验结果 显示， 应用人工合成的多肽Anti-HBxP2#对HepG2-X细胞生长和增殖具有明显的抑制作用。 *P 0.01， Student s t test 统计学分析 0020 图 7. 人工合成的多肽 Anti-HBxP2# 对 HepG2

21、.2.15 细胞的作用。裸鼠接种实验结 果显示， 应用人工合成的多肽Anti-HBxP2#对HepG2.2.15细胞生长和增殖具有明显的抑制 作用。*P 0.01， Student s t test 统计学分析 图 8. 构建多肽真核表达载体的连接示意图。 具体实施方式 0021 本发明中， 包括说明书和权利要求书， 使用的下列术语除非特别说明， 具有如下的 含义 ： 0022 “分离的” 一词是指将物质从它原始的环境 ( 例如， 若是自然产生的就指其天然环 境 ) 分离出来。比如说， 一个自然产生的多核苷酸或多肽存在于活动物中就是没有被分离 出来， 而同样的多核苷酸或多肽同一些或全部在自然系

22、统中与之共存的物质分开就是分离 的。这样的多核苷酸或多肽可以是某一载体的一部分， 也可以是某一组合物的一部分。既 然载体和组合物不是它的天然环境的成分， 它们仍然是分离的。 0023 “纯化的” 一词意指已经在纯度上提高的。 “纯度” 在这是相对术语， 并不必要地解 释为绝对纯度。例如， 纯度可以是至少约 50， 或可以是大于 60、 70、 80、 90、 或可 以是 100。 0024 如本发明中所用， 分离的物质是从其原始环境中分离出来。 活体 细胞内的天然状 态下的多核苷酸和多肽是没有分离的， 但同样的多核苷酸和多肽如从天然状态中同存在的 其他物质中分开， 则为分离的， 同时纯度上得到

23、了提高， 也因此是纯化的。 0025 “核酸” 、“核酸序列” 或 “碱基序列” 是指核苷酸， 寡核苷酸或多核苷酸及其片段或 部分。本发明的核酸能够以 RNA( 例如， mRNA) 的形态、 或 DNA 的形态 ( 例如， cDNA 或基因组 DNA) 存在。DNA 可以是双链， 也可以是单链。单链 DNA 或 RNA 可以是编码链 ( 有义链 )、 或 说 明 书 CN 102675423 A 5 4/23 页 6 非编码链 ( 反义链 ) 中任一种。另外， 本发明的多核苷酸也可以在其 5 端或 3 端融合编 码标签标记 ( 标签序列或标记物序列 ) 的多核苷酸。它们可以是合成的或是从天然来

24、源获 得的 ( 例如， 分离和 / 或纯化 )， 其可以包含天然的、 非天然的或者修饰过的核苷酸， 并且其 可以包含天然的、 非天然的或改变的核苷酸之间的键， 诸如氨基磷酸酯键或硫代磷酸酯键， 用来代替在未修饰的寡核苷酸中核苷酸之间存在的磷酸二酯键。 0026 所谓 “氨基酸序列” 或 “多肽” 是指肽、 寡肽、 多肽或蛋白质及其部分片段， 其间以 肽键相连接的氨基酸。当本发明中的 “氨基酸序列” 涉及一种天然存在的蛋白质分子的氨 基酸序列时， 这种 “多肽” 或 “蛋白质” 并不意味着将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子 相关的完整的天然氨基酸序列。本发明的氨基酸序列可以含有附加的肽。作为附加

25、的肽， 如多组氨酸标签 (His-tag)、 或 Myc、 FLAG 等表位标记的肽为例。 0027 “缺失” 是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一个或多个氨基酸或核苷酸的缺失。 0028 “插入” 或 “添加” 是指在氨基酸序列或核苷酸序列中的改变导致与天然存在或改 变前的分子相比， 一个或多个氨基酸或核苷酸的增加。 0029 “置换” 是指由不同的氨基酸或核苷酸替换一个或多个氨基酸或核苷酸。 0030 “缺失、 置换或添加一个或多个氨基酸或核苷酸” 则是指， 利用定位诱变法等公知 的突变核酸或多肽的制作法缺失、 置换或添加能够缺失、 置换或添加的程度的数目的氨基 酸或核苷酸。上述突变不限于利用

26、已知的定点突变法而人为诱导的突变， 也可以是对天然 存在的核酸或蛋白质的突变进行分离纯化而得到的。 对氨基酸的突变可以包含有一个或多 个氨基酸残基为构象为 D- 型的氨基酸， 自然界存在的稀有氨基酸或人工修饰的氨基酸， 这 些氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的。 与此相类似的， 诱导核酸发生突变， 可以 包括自然界天然存在的核苷酸， 也可以包括具有修饰的核苷酸。 0031 多肽的 “功能片段” 是指本发明的多肽的任何部分， 所述部分保留其作为一部分的 多肽 ( 即 “亲本” 多肽 ) 的基本相似或相同的生物学活性和功能。 0032 多肽的 “功能变体” 是指基本上保持如所述多肽或氨基酸序

27、列相同或相似的生物 学功能或活性的氨基酸序列， 它们可以包括， 例如， 1) 原氨基酸序列中一个或多个氨基酸残 基有缺失和/或一个或多个氨基酸残基被添加 ； 或者2)原氨基酸序列中一个或多个氨基酸 残基被保守或非保守氨基酸残基取代 ； 或者 3) 原氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基上 的某个基团被其它基团取代 ； 或者4)原氨基酸序列和另外的分子或化合物(比如糖、 脂类、 聚乙二醇等)的融合 ； 或者5)原有的氨基酸序列与添加的氨基酸序列融合进而形成的多肽 序列 ( 如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列等 ) ； 或者 6) 原氨基酸序列的逆反 类似物 ； 或者7)以上各种情况的混合。

28、本发明中， 氨基酸序列的功能变体， 可以包含有一个 或多个氨基酸残基为构象为 D- 型的氨基酸， 自然界存在的稀有氨基酸或人工修饰的氨基 酸， 这些氨基酸可以是也可 以不是由遗传密码子编码的。 0033 多肽的 “逆反类似物” 是指包括反转的亲本多肽氨基酸序列的多肽， 以致所述逆反 类似物的氨基酸序列 ( 当从 N 端向 C 端读取时 ) 与当从 C 端向 N 端读取时的亲本多肽的氨 基酸序列相同 ； 此外， 逆反类似物中每一个氨基酸是该氨基酸的 D 异构体， D 异构体与 L 异 构体相反。例如， 三肽 Val-Ala-Gly 的逆反类似物具有氨基酸序列 Gly-Ala-Val， 其中每个

29、氨基酸是 D 异构体。 0034 本发明中，“肽模拟物” 是指具有与相对应多肽基本相同的通用结构且具有， 例如， 说 明 书 CN 102675423 A 6 5/23 页 7 能增加其稳定性或生物学功能的修饰的化合物。 肽模拟物包括， 例如， 包含与相对应多肽的 相同氨基酸序列的那些化合物， 但在其中两个或更多个氨基酸之间， 肽模拟物具有改变的 主链。所述肽模拟物可以包括合成的或非天然存在的氨基酸来代替天然存在的氨基酸。 0035 本发明中， 核苷酸序列的 “简并变异体” 是这样的多核苷酸序列， 其与亲本核苷酸 序列有区别， 但编码的蛋白质和多肽和亲本核苷酸序列所编码的蛋白质或多肽一样。 0

30、036 “核酸杂交” 在本领域已公知 ( 参见， 例如， Sambrook 等， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 3rd Ed.， Cold Spring Harbor Laboratory， 2001)。通常， 温度越高， 盐浓度越低， 则严谨性变得越高 ( 难以杂交 )， 从而能够取得更加相同的多核苷酸。适合的 杂交温度根据碱基序列或其碱基序列的长度而异。另外， 本发明还涉及在 “严格条件” 下杂 交。本发明中，“严格条件” 是指， 在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱， 例如， 42的 条件下、 在 (50甲酰胺、 5SSC(150mM

31、 NaCl、 15mM 柠檬酸三钠 )、 50mM 的磷酸钠 (pH7.6)、 5Denhardt溶液、 10硫酸葡聚糖、 和20g/ml的变性剪切鲑鱼精子DNA)中孵育过夜， 然 后在 65条件下用 0.1SSC 洗脱。 0037 “同源性” 是指互补的程度， 可以是部分同源， 也可以是完全同源。 “部分同源” 是 指一种部分互补的序列， 其可部分抑制完全互补的序列与靶核酸的杂交。这种抑制可通过 在严格性程度降低的条件下进行杂交 (Southern 印迹或 Northern 印迹等 ) 来检测。基本 同源的序列或杂交探针可竞争和抑制完全互补的序列与靶序列在严格性程度降低的条件 下的结合。当然

32、， 严格性降低的条件并非允许非特异性的结合， 两条序列相互结合， 仍然需 要特异性或选择性的相互作用。 0038 氨基酸序列或核苷酸序列的 “相同性” 或 “同一性” 百分率是指在两种或多种氨 基酸或核苷酸序列比较中， 序列相同或相似的百分率。有很多本领域技术人员熟知的方法 测定相同性百分率， 如通过 MEGALIGN 程序 (Lasergene software package， DNASTA， Inc.， Madison， WI)。MEGALIGN 程序可根据不同的方法如 Cluster 法比较两种或多种序列 ( 参见 Higgins & Sharp， Gene 73 ： 237-244，

33、 (1988)， Gluster法通过检查所有配对之间的距离将 各组序列排列成簇， 然后将簇以成对或成组分配。两个氨基酸序列如序列 A 和序列 B 之间 的相同性百分率可以通过下式计算 ： 0039 ( 序列 A 与序列 B 之间匹配的残基个数 )/( 序列 A 的残基数 - 序列 A 中间隔残基 数 - 序列 B 中间隔残基数 )X 100 0040 同理， 也可以通过Cluster法或用本领域已知的方法， 如Jotun Hein的方法(参见 Hein J.， Methods in Emzumology 183 ： 625-645， 1990)， 测定核酸序列的相同性百分率。 0041 “重

34、组表达载体” 是指遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸重组体， 该重组体克隆有 编码 mRNA、 蛋白、 多肽、 或肽的核苷酸序列， 当该表达载体进入宿主细胞后可表达相应的 mRNA、 蛋白、 多肽、 或肽。本发明中， 重组表达载体可以包含任意类型的核苷酸序列， 但不仅 限于是 DNA 或 RNA， 可为单链或双链、 人工合成或来自天然， 也可为 非天然的或改变的核苷 酸。核苷酸之间的键可以是天然存在的、 也可以是非天然存在的或修饰的。 0042 本发明中，“乙肝病毒感染后的慢性肝病” 是指乙型肝炎病毒感染后导致的肝病， 包括慢性肝炎、 慢性肝炎反复发作引起的肝组织中纤维结缔组织增生后发生的肝硬变，

35、及 大部分在肝硬变基础上发生的肝癌。肝癌的发生是乙型肝炎病毒持续感染的结果， 这种肝 癌可称之为乙肝后肝癌。 说 明 书 CN 102675423 A 7 6/23 页 8 0043 本发明中，“治疗” 和 “预防” 以及由它们派生的词语， 但并不意味是 100的或完全 的治疗或预防， 可以认定为本领域技术人员所认同的治疗或预防程度。本发明中的 “预防” 可理解为延迟疾病、 或其症状或病症的发作。 0044 多肽 0045 本发明提供分离或纯化的多肽。 本发明涉及的多肽可以是包含、 基本由、 或由氨基 酸序列 Pro-Asp-Leu-His-Lys-Asn-Glu-Leu-Lys-His-Va

36、l-Lys-Tyr(SEQ ID NO ： 1) 所组成 的多肽。研究证实这些多肽可以明显抑制 HBx 的活性， 具有明显抑制乙肝病毒感染后的慢 性肝病的发生和发展的作用， 更重要的是， 这些多肽可以抑制感染有乙肝病毒的肝癌细胞 的生长和增殖。 0046 所述抑制在分子水平、 细胞水平和动物水平均有体现。 如， 所述多肽在分子水平上 可以抑制由 HBx 激活的核因子 B(NF-B) 的启动子活性， 从而体现所述多肽对 HBx 的有效抑 制， 且其抑制效果呈量效关系 ； 所述多肽在细胞水平也体现出对含 HBx 基因的肝癌细胞的 生长和增殖功能的有效抑制， 且其抑制效果也呈量效关系 ； 通过裸鼠接

37、种方法显示， 所述多 肽在动物水平能有效抑制表达 HBx 的肝癌细胞的成瘤能力。然而， 所述多肽对无表达 HBx 肝癌细胞中 NF-B 的启动子活性无影响， 对无表达 HBx 肝癌细胞的生长和增殖也无影响。 0047 本发明还提供所述本发明多肽的各种功能片段。 所述功能片段可以为本发明的多 肽的连续氨基酸序列的任何片段， 条件是其与亲本多肽相比， 能以相似程度、 相同程度、 或 更高程度保留亲本多肽的生物活性， 例如， 抑制 HBx 的活性。参照亲本多肽， 所述功能片段 可以包括， 例如， 亲本多肽的约 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 95、 100、

38、105、 110、 120、 150、 200或更高的活性。所述功能片段还可以在上述连续 氨基酸序列片段的氨基或羧基端、 或其氨基以及羧基两端， 包含额外的氨基酸， 例如， 与亲 本多肽的氨基酸序列中不同的氨基酸。 如果所述额外的氨基酸不妨碍所述功能片段的生物 学功能是理想的， 例如， 抑制 HBx 的活性， 并有效地抑制癌细胞， 优选是肝癌细胞， 尤其是感 染有乙肝病毒的肝癌细胞的生长和增殖。更为理想的是， 当与所述亲本多肽的生物学活性 相比较时， 所述额外的氨基酸能够导致增强的生物学活性。本发明的多肽的功能片段包括 与所述亲本多肽具有至少70的序列同一性的氨基酸序列为优选序列。 在一个具体

39、的实施 例中， 本发明的功能片段包括在所述亲本多肽的 N 端和 / 或 C 端添加氨基酸， 例如一个或两 个氨基酸。 0048 另外， 本发明的多肽及其功能片段的功能变体也包括在本发明范围之内。所述本 发明的多肽及其功能片段的功能变体保留与所述亲本多肽或亲本功能片段基本相似或相 同的生物活性， 例如， 抑制 HBx 的活性， 以及有效地抑制肝癌细胞， 尤其是感染有乙肝病毒 的肝癌细胞的生长和增殖。参照所述亲本多肽或亲本功能片段， 所述功能变体可以与所 述亲本多肽或亲本功能片段的氨基酸序列至少有约 50、 60、 70、 80、 90、 95或 100的同一性。优选地， 本发明的多肽及其功能片段

40、的功能变体包含， 与所述亲本多肽或 亲本功能片段具有至少 70的序列同一性。更优选的， 本发明的多肽及其功能片段的功能 变体包含与所述亲本多肽或亲本功能片段只有 1-3 个氨基酸的区别。最优选地， 本发明的 多肽及其功能片段的功能变体包含与所述亲本多肽或亲本功能片段只有 1 个氨基酸的区 别。 0049 所述本发明的多肽及其功能片段的功能变体可以包括， 例如， 包含具有至少一个 说 明 书 CN 102675423 A 8 7/23 页 9 保守氨基酸置换的亲本多肽或亲本功能片段氨基酸序列。具体来说， 所述本发明的多肽及 其功能片段的功能变体可以包含具有2个、 3个、 4个、 5个、 或更多个

41、保守氨基酸置换的亲本 多肽或亲本功能片段的氨基酸序列。另外， 所述本发明的多肽及其功能片段的功能变体也 可以包括具有至少一个非保守氨基酸置换的亲本多肽或亲本功能片段的氨基酸序列。 具体 来说， 可以包括具有 2 个、 3 个、 4 个、 5 个、 或更多个非保守氨基酸置换的亲本多肽或亲本功 能片段的氨基酸序列。 在这些情形中， 对于所述的氨基酸置换， 优选的是不妨碍或抑制所述 功能变体的生物学功能或活性。更优选地， 所述氨基酸置换提高本发明的多肽及其功能片 段的功能变体的生物学功能或活性， 以致当与所述亲本多肽或亲本功能片段相比较时， 所 述功能变体的生物学功能或活性提高。 0050 优选地，

42、 本发明的多肽及其功能片段的功能变体包括一个或多个保守氨基酸置 换。 在本领域内， 保守氨基酸置换是公知的， 它指的是这样的氨基酸置换， 即， 其中一个具有 某种物理和 / 或化学特性的氨基酸被换为另一个具有相同化学或物理特性的氨基酸。本领 域技术人员了解， 保守性的氨基酸置换可以不造成蛋白质的结构或功能的显著改变。典型 的保守性置换包括， 例如， 用酸性氨基酸置换另一个酸性氨基酸(例如， AsP或Glu)， 用具有 非极性侧链的氨基酸置换另一个具有非极性侧链的氨基酸 ( 例如， Ala， Gly， Val， Ile， Leu， Met， Phe， Pro， Trp， Val， 等 )， 用碱

43、性氨基酸置换另一个碱性氨基酸 (Lys， Arg， 等 )， 用具有 极性侧链的氨基酸置换另一个具有极性侧链的氨基酸 (Asn， Cys， Gln， Ser， Thr， Tyr， 等 )， 用芳香氨基酸 (Trp， Phe， Tyr， 等 ) 置换另一个芳香氨基酸， 等。 0051 另外， 本发明的多肽及其功能片段的功能变体还可以包括本发明的任意多肽或功 能片段的逆反类似物。本发明中，“逆反类似物” 是 指包括反转的亲本多肽氨基酸序列的 多肽， 以致所述逆反类似物的氨基酸序列 ( 当从 N 端向 C 端读取时 ) 与当从 C 端向 N 端读 取时的亲本多肽的氨基酸序列相同。此外， 关于逆反类似

44、物， 每一个氨基酸是该氨基酸的 D 异构体， D 异构体与 L 异构体相反。例如， 三肽 Val-Ala-Gly 的逆反类似物具有氨基酸序列 Gly-Ala-Val， 其中每个氨基酸是 D 异构体。本发明中， 所述功能变体优选包括 SEQ ID NO ： 1 的逆反类似物。 0052 本发明的多肽 ( 包括功能片段 ) 及其功能变体可以是任意长度的， 即， 可以包括 任意数目的氨基酸， 条件是所述多肽 ( 包括功能片段 ) 及其功能变体保留必要的生物学活 性， 例如， 抑制 HBx 的活性， 以及有效地抑制癌细胞， 优选是肝癌细胞， 尤其是感染有乙肝病 毒的肝癌细胞。举例来说， 本发明的多肽

45、( 包括功能片段和功能变体 ) 可以是 4-2000 个氨 基酸长， 如长度为 5， 6， 7， 8， 9， 10， 11， 12， 13， 14， 15， 16， 18， 20， 25， 30， 40， 50， 60， 70， 80， 90， 100， 125， 150， 175， 200， 300， 400， 500， 700， 800， 1000 或更多。优选地， 本发明的多肽长度为 6-20 个氨基酸， 并满足作为多肽药物的药效学和半衰期的要求。 0053 在一个实施例中， 本发明的多肽及其功能片段的功能变体与亲本多肽 SEQ ID NO ： 1 具有一个氨基酸的差别， 其具有与亲本多

46、肽 SEQ ID NO ： 1 相似的生物学活性和功能， 例 如， 抑制 HBx 的活性， 以及有效地抑制癌细胞， 优选是肝癌细胞， 尤其是表达 HBx 的肝癌细 胞。更具体地， 本发明的多肽及其功能片段的功能变体包括 SEQ ID NOs ： 2-6。 0054 本发明还提供所述多肽 ( 包括功能片段和功能变体 ) 的肽模拟物。在一个优选的 实施方案中， 所述肽模拟物是拟肽。拟肽是指这样的肽模拟物， 其中每个氨基酸的侧链粘 附在氨基酸的氮原子上而不是 碳上。例如， 拟肽可以被视为 N- 置换的甘氨酸， 其具有 说 明 书 CN 102675423 A 9 8/23 页 10 NRCH2CO

47、通用结构的重复单位， 并且其具有与相对应的多肽相同或基本相同的氨基酸序列。 在另一个优选的实施方案中， 所述肽模拟物包括改变的主链， 其中在每个氨基酸之间的键 是甲基化的。在这一点上， 所述肽模拟物 可以包括下述结构的甲基化肽主链 ： 0055 0056 本发明的多肽 ( 包括功能片段和功能变体 ) 以及肽模拟物中， 可以包括用合成 的氨基酸来置换天然存在的氨基酸。所述合成的氨基酸在本领域内是已知的， 包括， 例 如， 氨基环己烷羧酸、 正亮氨酸、 - 氨基正癸酸、 高丝氨酸、 S- 乙酰氨基甲基 - 半胱氨酸、 反式 -3- 羟脯氨酸、 反式 -4- 羟脯氨酸、 4- 氨基苯丙氨酸、 4-

48、苯甲酰苯丙氨酸、 4- 硝基苯 丙氨酸、 4- 氯苯丙氨酸、 4- 羧基苯丙氨酸、 - 苯基丝氨酸、 - 羟基苯丙氨酸、 苯基甘氨 酸、 - 萘基丙氨酸、 环己基丙氨酸、 环己基甘氨酸、 二氢吲哚 -2- 羧酸、 1， 2， 3， 4- 四氢异哇 琳 -3- 羧酸、 氨基丙二酸、 氨基丙二酸单酞胺、 N - 苄基 -N - 甲基 - 赖氨酸、 N， N - 二 苄基 - 赖氨酸、 6- 羟基赖氨酸、 鸟氨酸、 - 氨基环戊烷羧酸、 - 氨基环己烷羧酸、 - 氨 基环庚烷羧酸、 -(2- 氨基 -2- 降冰片烷 )- 羧酸、 ， - 二氨基丁酸、 ， - 二氨基丙 酸、 高苯丙氨酸、 和 - 叔

49、 - 丁基甘氨酸。 0057 本文所述的本发明的多肽 ( 包括功能片段和功能变体 ) 以及肽模拟物还可以 包含细胞 - 穿透肽 (CPP)。所述 CPP 促进本发明多肽穿过细胞膜并且进入细胞内。CPPs 在本领域中是已知的。参见， 例如， Deshayes 等， 细胞分子生命科学 (Cell.Mol.Life Sci.)62 ： 1839-1849(2005) ； EI-Andaloussi 等， 现代药物设计 (Curr.Pharm.Design.)11 ： 3597-3611(2005)。所述 CPP 可以是本领域已知的那些中的任一种。 0058 本发明的多肽 ( 包括功能片段和功能变体 ) 以及肽模拟物还可以， 例如， 被脂化 ( 例如， 脂肪酸化 )、 糖基化、 酰胺化、 羧酸化、 磷酸化、 酯化、 N- 酰化、 通过二硫键环化