山楂叶及其提取物的新用途.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102697901 A (43)申请公布日 2012.10.03 CN 102697901 A *CN102697901A* (21)申请号 201210203314.2 (22)申请日 2010.06.23 201010206623.6 2010.06.23 A61K 36/734(2006.01) A61P 27/12(2006.01) A61K 127/00(2006.01) (71)申请人 天津中医药大学 地址 300193 天津市南开区玉泉路 88 号 (72)发明人 王涛 赵春风 刘二伟 胡利民 张德芹 高秀梅 李玉红 (74)专利代理机构 天津市三利专利

2、商标代理有 限公司 12107 代理人 李蕊 (54) 发明名称 山楂叶及其提取物的新用途 (57) 摘要 本发明提供了山楂叶及其提取物在制备预防 和治疗白内障的药物中的用途， 所述山楂叶及其 提取物通过抑制醛糖还原酶， 增强机体抗氧化能 力， 从而有望用于制备预防和治疗白内障的药物， 进而达到对于白内障的治疗目的。 (62)分案原申请数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 山楂叶作为唯一活性成分在制备预防和治疗白内障的药物

3、中的用途。 2. 山楂叶乙醇提取物作为唯一活性成分在制备预防和治疗白内障的药物中的用途。 3. 根据权利要求 2 所述的用途， 其特征在于所述山楂叶乙醇提取物为山楂叶 50%-95% 乙醇提取物。 权 利 要 求 书 CN 102697901 A 2 1/8 页 3 山楂叶及其提取物的新用途 技术领域 0001 本发明涉及山楂叶及其提取物的新用途。 背景技术 0002 白内障是由于晶状体混浊， 失去双透镜作用， 使光线不能透过晶状体到达视网膜， 导致患者失明的一种常见眼科疾病， 也是世界首位致盲因素， 大多是因为老化和代谢障碍 如糖尿病等引发。 白内障的发病机制复杂， 目前认为在高血糖情况下多

4、元醇通路被激活， 导 致多元醇积聚， 引起晶体纤维水肿， 蛋白质合成减少、 蛋白质分解、 裂解及细胞结构的破坏， 最后晶体皮质和核浑浊， 白内障形成。 醛糖还原酶 （AR） 是多元醇代谢通路的关键限速酶， 在 高血糖生理状态或组织过度利用糖时被激活， 促使体内过量葡萄糖转化为山梨醇。山梨醇 在细胞内大量蓄积可改变细胞膜的通透性， 造成细胞渗透性水肿， 进而出现糖尿病并发症， 尤其在 AR 含量较高的敏感部位， 肾小球基底膜、 视网膜及外周神经等。大量动物实验及临 床研究表明醛糖还原酶抑制剂 （ARI） 能有效改善多元醇代谢通路异常， 治疗和预防白内障。 0003 现代白内障囊外摘除或超声乳化术

5、联合后房人工晶状体植入术是当前治疗白内 障的主要手段。术后晶状体后囊浑浊即后发性白内障的发生会使术后提高的视力再度下 降， 影响手术效果且费用昂贵。 因此， 探讨用药物防治白内障， 寻找疗效确切、 廉价的防治白 内障新药就成为药学工作者研究的重点。 0004 山楂叶为蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.或 山楂 C.pinnatifida Bge. 的叶子。性酸、 甘、 平， 主入肝经。 中国药典 2005 年版载其具 有 “活血化瘀， 理气通脉” 的作用。因此进一步研究山楂叶的药理作用， 将其用于白内障的 预防和治疗， 是现阶

6、段一个新的研究方向， 具有重要的临床意义。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题在于提供山楂叶的新用途。 0006 本发明所要解决的另一技术问题在于提供山楂叶提取物的新用途。 0007 为解决上述技术问题， 本发明的技术方案是 ： 0008 本发明提供了山楂叶在抑制醛糖还原酶活性中的用途。 0009 本发明提供了山楂叶在增强晶状体的抗氧化能力， 减少晶状体的氧化损 伤中的 用途。 0010 本发明提供了山楂叶在制备醛糖还原酶抑制药物中的用途。 0011 本发明提供了山楂叶在制备预防和治疗白内障的药物中的用途。 0012 本发明提供了山楂叶提取物在抑制醛糖还原酶活性中的用途。 0013

7、本发明提供了山楂叶提取物在增强晶状体的抗氧化能力， 减少晶状体的氧化损伤 中的用途。 0014 本发明提供了山楂叶提取物在制备醛糖还原酶抑制药物中的用途。 0015 本发明提供了山楂叶提取物在制备预防和治疗白内障的药物中的用途。 说 明 书 CN 102697901 A 3 2/8 页 4 0016 优选的， 上述用途中所述山楂叶提取物为山楂叶乙醇提取物。 0017 优选的， 上述用途中所述山楂叶乙醇提取物为山楂叶 50%-95% 乙醇提取物。 0018 本发明还提供了实现上述用途的药物组合物， 包含治疗有效量的山楂叶和 / 或山 楂叶提取物以及任选的药学可接受的赋形剂。 0019 上述药学可

8、接受的赋形剂可以是药物制剂领域中任何常规的赋形剂， 特定赋形剂 的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态， 用于特定给药模式的合 适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。例如， 可以作为药学可 接受的赋形剂包括药学领域常规的稀释剂、 载体、 填充剂、 粘合剂、 湿润剂、 崩解剂等。 0020 上述组合物可以制成滴剂、 片剂、 粉剂、 颗粒剂、 胶囊、 口服液、 注射乳剂、 注射用无 菌粉针等多种形式， 上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。 0021 本发明的有益效果是 ： 0022 山楂叶及其提取物通过抑制醛糖还原酶， 增强机体抗氧化能力， 从

9、而有望用于制 备治疗白内障的药物， 进而达到对于白内障的治疗目的。 附图说明 0023 图 1A 为山楂叶 HPLC 图谱 ； 0024 图 1B 为山楂叶提取物 HPLC 图谱。 具体实施方式 0025 为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案， 下面结合具体实施方式 对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。 0026 实施例 1 0027 山楂叶提取物的制备 0028 称取干燥山楂叶 1kg， 加入 70% 乙醇 10L， 沸腾回流提取 2 小时， 过滤， 残渣中加入 70%乙醇10L， 沸腾回流提取2小时， 过滤， 两次滤液合并， 40水浴加热减压浓缩至干， 得到 山楂叶 70%

10、 乙醇提取物 214g。 0029 实施例 2 0030 山楂叶提取物的制备 0031 称取干燥山楂叶 1kg， 加入 50% 乙醇 10L， 沸腾回流提取 2 小时， 过滤， 残渣中加入 50%乙醇10L， 沸腾回流提取2小时， 过滤， 两次滤液合并， 40水浴加热减压浓缩至干， 得到 山楂叶 50% 乙醇提取物 235g。 0032 实施例 3 0033 山楂叶提取物的制备 0034 称取干燥山楂叶 1kg， 加入 90% 乙醇 10L， 沸腾回流提取 2 小时， 过滤， 残渣中加入 90%乙醇10L， 沸腾回流提取2小时， 过滤， 两次滤液合并， 40水浴加热减压浓缩至干， 得到 山楂叶

11、 90% 乙醇提取物 201g。 0035 实施例 4 0036 山楂叶提取物的制备 0037 山楂叶药材1kg用10倍量70%乙醇提取2次， 每次2h， 提取液减压浓缩挥去乙醇， 说 明 书 CN 102697901 A 4 3/8 页 5 滤过。滤液用 D101 大孔树脂吸附， 树脂床体积与生药量之比为 1:1（w/v） ； 上样后， 先以 2 倍树脂床体积的水洗涤， 弃去水洗液， 用4倍树脂床体积的70%乙醇洗脱， 洗脱液减压浓缩， 真空干燥， 即得山楂叶提取物 88g。 0038 实施例 5 0039 山楂叶和山楂叶提取物中金丝桃苷的测定 0040 1 仪器和试药 0041 Agile

12、nt 1100 液相色谱系统 （VWD 检测器） ； 甲醇， 乙腈， 四氢呋喃为色谱纯 ； 金丝 桃苷对照品 （中国药品生物制品检定所， 批号 111521-200303） ； 山楂叶药材采自天津蓟县 青山岭， 并经天津中医药大学中医药研究院郭俊华副研究员鉴定为蔷薇科植物山楂的叶。 D101 大孔树脂 （天津市海光化工有限公司， 净品型） 。 0042 2 方法与结果 0043 2.1 山楂叶提取物的制备 0044 山楂叶药材用 10 倍量 70% 乙醇提取 2 次， 每次 2h， 提取液减压浓缩挥去乙醇， 滤 过。滤液用 D101 大孔树脂吸附， 树脂床体积与生药量之比为 1:1（w/v）

13、； 上样后， 先以 2 倍 树脂床体积的水洗涤， 弃去水洗液， 用 4 倍树脂床体积的 70% 乙醇洗脱， 洗脱液减压浓缩， 真空干燥， 即得山楂叶提取物。 0045 2.2 供试品溶液的制备 0046 2.2.1 山楂叶中金丝桃苷含量测定供试品溶液 0047 取山楂叶药材粉末1.0g， 精密称定， 加70%乙醇100ml回流提取2小时， 补足失重， 0.45m 微孔滤膜过滤， 即得。 0048 2.2.2 山楂叶提取物中金丝桃苷含量测定供试品溶液 0049 取山楂叶提取物 20mg， 精密称定， 置 25ml 量瓶中， 加甲醇约 20ml， 超声处理 （功率 250W， 频率 40kHz）

14、5 分钟， 用甲醇稀释至刻度， 摇匀， 0.45m 微孔滤膜过滤， 即得。 0050 2.3HPLC 条件 0051 大连依利特色谱柱 （Hypersil ODS， 4.6mm250mm， 5m） ， 流动相为乙腈 ： 甲醇 ： 四氢呋喃 ： 0.5% 醋酸 1 ： 1 ： 19.4 ： 78.6（v/v） ， 流速 ： 1mLmin-1 ； 检测波长 363nm。 0052 2.4 方法学考察 0053 金丝桃苷的标准曲线的制备 ： 精密称定金丝桃苷对照品适量， 用甲醇配成系列浓 度的对照品溶液， 按 2.3 色谱条件测定， 金丝桃苷的回归方程为 Y(A)=17997X(C)+35.17，

15、相关 系数 r=0.9995， 线性范围为 8-320g.mL-1。 0054 金丝桃苷最低检测限 （LOD） 和最低定量限 （LOQ） 分别为 1g.mL-1和 3g.mL-1。 日间精密度和日内精密度均小于 4%。加样回收率为 96-104%（RSD%2%） 。 0055 2.5 含量测定结果 0056 经测定， 山楂叶及山楂叶提取物中金丝桃苷含量分别为 0.16% 和 2.35%。 0057 色谱图见图 1A 和图 1B。 0058 实施例 6 0059 对蛋白质糖基化终末产物形成抑制 0060 1相关溶液配制 0061 10mM- 巯基乙醇含有 135mM 磷酸缓冲液 （pH7.0）

16、配制方法 ： 精确称取磷酸二氢 说 明 书 CN 102697901 A 5 4/8 页 6 钾 18.36g、 磷酸氢二钠 19.17g， 分别加入 1L 蒸馏水中， 两溶液混合调节 pH 值至 7.0， 按 74.18mg/100ml 加入 - 巯基乙醇， 振荡溶解。 0062 180mM 磷酸缓冲液 （pH7.0） 配制方法 ： 精确称取磷酸二氢钾 24.48g、 磷酸氢二钠 25.56g， 分别加入 1L 蒸馏水中， 两溶液混合调节 pH 值至 7.0。 0063 1.0M 硫酸锂溶液配制方法 ： 精确称取硫酸锂 1.1g 溶于 10ml 蒸馏水中振荡溶解。 0064 10mM DL-

17、 甘油醛溶液配制方法 ： 精确称取 0.9gDL- 甘油醛溶于 1L 蒸馏水中振荡 溶解。 0065 10mM 咪唑含 6M 氢氧化钠溶液配制方法 ： 精确称取 240g 氢氧化钠溶解于 1L 蒸馏 水中， 再称取 6.8g 咪唑振荡溶解。 0066 0.3mM NADPH 溶液配制方法 ： 精确称取 2.5mg NADPH 加入 10ml 180mM 磷酸缓冲液 （pH7.0） 振荡溶解， 取出 1ml 溶液， 加入 27ml 180mM 磷酸缓冲液 （pH 7.0） , 配成 0.01M 的 NADPH 溶液， 冰浴保存。 0067 2样品溶液配制 0068 用 DMSO 溶解实施例 1

18、所述山楂叶 70% 乙醇提取物， 配成 64mg/ml 的溶液， -20保 存。 0069 实验前将样品 DMSO 溶液用 180mM 磷酸缓冲液 (pH 7.0）稀释成 400g/ml、 200g/ml、 100g/ml、 50g/ml、 25g/ml、 12.5g/ml、 6.25g/ml、 0g/ml， 各样品溶 液在终浓度时所含 DMSO 体积相等且小于 2.5%。 0070 3醛糖还原酶制备 0071 （1） 醛糖还原酶提取方法 0072 Wistar 大鼠脱臼处死， 立即摘取眼球， 采用后路手术摘取晶状体 （冰上进行） 放入 20ml10mM- 巯基乙醇含有 135mM 磷酸缓冲液

19、 （pH 7.0）中， 匀浆， 100000g、 4 C 离心 30min， 取上清， -20保存。 0073 （2） 醛糖还原酶筛选方法 0074 实验在玻璃试管中进行， 设三组， 每组 4 个复孔， 分别为对照组 A、 样品组 B、 空 白组 C， 各样品测试组， 180mM 磷酸缓冲液 （pH7.0） 225l、 1.0M 硫酸锂溶液 50l、 10mM DL- 甘油醛溶液 50l、 提取的酶溶液 100l 和样品溶液 25l 混合， 30预热 3min， 加入 0.3mMNADPH 溶液 50l， 30反应 30min， 加入 0.5M 的盐酸 150l 终止反应 ； 标准曲线组， 1

20、80mM磷酸缓冲液 （pH7.0） 2450l、 1.0M硫酸锂溶液700l、 10mM DL-甘油醛溶液700l、 二甲基亚砜 350l、 提取的酶溶液 1400l 和 0.5M 的盐酸 2100l 混合后取出 600l， 分别加入 NADP 溶液使其终浓度为 0M、 1M、 2M、 4M、 8M、 16M， 各测试管分别加入 10mM 咪唑含 6M 氢氧化钠溶液， 60反应 20min， 室温放冷后于激发波长 360nm， 发射波长 460nm 检测荧光吸收度。 0075 4 抑制活性计算方法 0076 按照以下公式计算有效组分各浓度的抑制率， 据各浓度的抑制率计算出 IC50。 0077

21、 抑制率 （%） =（A-B） /（A-C） 100 0078 其中 A 为对照组吸收度， B 为样品组吸收度， C 为空白组吸收度。 0079 实验结果 0080 山楂叶 70% 乙醇提取物醛糖还原酶半数抑制浓度 （IC50） 为 89.7g/ml， 表明山楂 说 明 书 CN 102697901 A 6 5/8 页 7 叶 70% 乙醇提取物具有抑制醛糖还原酶活性， 可以用于制备预防和治疗白内障的药物， 进 而治疗白内障。 0081 实施例 7 0082 山楂叶 70% 乙醇提取物对硒诱导的白内障大鼠的治疗作用 0083 1实验动物 0084 出生 12 天的 Wistar 大鼠 60 只

22、 （自己繁殖） ， 由母鼠喂养， 饲养在天津中医药大学 实验动物中心， 环境设施符合 中华人民共和国卫生部实验动物环境设施标准 二级标准， 合格证号为医动字第 01-19981109 号。 0085 2药品配制方法 0086 制备滴眼液 ： 精确称取实施例1所述一定量的山楂叶70%乙醇提取物， 溶于双蒸水 中振荡溶解配成 1mg/ml、 2mg/ml 的溶液， 抽滤后得滴眼液。 0087 动物分组 0088 出生 12 天的 Wistar 乳鼠， 雌雄不拘， 平行分成正常组、 模型组、 山楂叶 70% 乙醇提 取物高剂量组 （4mg/kg） 、 山楂叶 70% 乙醇提取物低剂量组 （2mg/k

23、g） 、 阳性对照组 （吡诺克辛 钠滴眼液， 商品名 ： 白内停， 武汉远大制药集团股份有限公司， 批号 080925） ， 每组 12 只， 母 乳喂养。 0089 白内障模型制作及给药 0090 于乳鼠出生第 12 天用镊子轻轻打开乳鼠的眼睑成杯状， 正常组和模型组滴入蒸 馏水， 给药组滴入上述不同浓度的山楂叶 70% 乙醇提取物滴眼液， 阳性对照组滴入吡诺克 辛钠滴眼液 2ml/kg 体重， 保持眼睛睁开约 1min， 防止药液溢出眼外， 每 8h 给药 1 次， 连续 7 日。于乳鼠出生第 14 天皮下注射亚硒酸钠 19mol/kg 体重， 96h 后肉眼观察白内障程度， 水 合氯醛麻

24、醉， 腹主动脉取血、 采集晶状体， -80保存。 0091 4 样本采集 0092 腹主动脉取血后， 迅速摘取眼球， 采用后路手术法剥离晶状体， 用粗滤纸吸干 , 称 重， -80保存。 0093 检测方法 0094 1 血清指标检测 0095 血液 3500rmin-1， 4离心 10min， 分离出血清。用超氧化合物歧化酶试剂盒、 丙 二醛试剂盒、 过氧化氢酶试剂盒 （均为南京建成生物有限公司生产） ， 于多功能读板机上检 测超氧化合物歧化酶 （SOD） 、 丙二醛 (MDA)、 过氧化氢酶 （CAT） 水平。 0096 2 晶状体生化检测 0097 晶状体称重后置匀浆管中， 加入冰 1.

25、0ml 180mM 磷酸缓冲液 （pH7.0） ， 匀浆， 3500rmin-1， 4离心 10min， 取上清液 , 用超氧化合物歧化酶试剂盒、 丙二醛试剂盒、 谷胱 甘肽试剂盒、 过氧化氢酶试剂盒 （均为南京建成生物有限公司生产） ， 于多功能读板机上检 测 SOD、 MDA、 GSH、 CAT ； 荧光分光光度法检测醛糖还原酶活性。 0098 4 实验结果 0099 4.1 血清指标检测结果 0100 乳鼠血清 SOD、 CAT 的活性及 MDA 含量见表 1， 可知模型组乳鼠血清 SOD 活性比正 常组比显著性降低， 吡诺克辛钠滴眼液、 山楂叶70%乙醇提取物高剂量组和山楂叶70%乙醇

26、 说 明 书 CN 102697901 A 7 6/8 页 8 提取物低剂量组均能显著性提高亚硒酸钠诱导的白内障乳鼠血清 SOD 的活性 ； 吡诺克辛钠 滴眼液、 山楂叶 70% 乙醇提取物高剂量组乳鼠血清 SOD 的活性明显高于正常组， 山楂叶 70% 乙醇提取物高剂量的作用优于吡诺克辛钠滴眼液组。模型组乳鼠血清 CAT 活性与正常组比 显著性下降， 吡诺克辛钠滴眼液、 山楂叶 70% 乙醇提取物高剂量组均能显著性提高乳鼠血 清 CAT 的活性， 山楂叶 70% 乙醇提取物低剂量组有提高乳鼠血清 CAT 活性的趋势。各剂量 组乳鼠血清 MDA 含量没有显著性差异。 0101 表 1 乳鼠血清

27、 SOD、 CAT 的活性和 MDA 含量 0102 0103 与模型对照组比较有显著性差异 *p0.05， *p0.01 0104 4.2 晶状体生化检测结果 0105 乳鼠晶状体 SOD、 CAT、 AR 活性及 GSH 含量见表 2， 模型组晶状体 CAT 活性与正常组 晶状体 CAT 活性显著性降低， 阳性对照组和山楂叶 70% 乙醇提取物高低剂量治疗组均能显 著性升高晶状体 CAT 活性但仍然没有使其恢复到正常水平。模型组晶状体 SOD 活性与正常 组比显著性降低， 吡诺克辛钠滴眼液治疗组、 山楂叶 70% 乙醇提取物高低剂量组均能显著 性提高晶状体 SOD 活性， 除山楂叶低剂量治

28、疗组外其余各组均能使其恢复到正常水平。模 型组晶状体 GSH 含量与正常组晶状体 GSH 含量比显著性下降， 阳性对照组和山楂叶 70% 乙 醇提取物高低剂量治疗组均能显著性升高晶状体 GSH 含量且使其基本达到正常水平。 0106 表 2 乳鼠晶状体 SOD 活性、 CAT 活性、 GSH 含量 0107 说 明 书 CN 102697901 A 8 7/8 页 9 0108 与模型对照组比较有显著性差异 *p0.05， *p0.01 0109 结论 ： 0110 1、 山楂叶 70% 乙醇提取物能显著性降低硒诱导的白内障乳鼠血清 SOD、 CAT 活性， 增强机体整体抗氧化能力， 可以降低

29、白内障发生率， 提示该药物可以用于白内障治疗和预 防。 0111 2、 山楂叶 70% 乙醇提取物能显著性增强硒诱导的白内障乳鼠晶状体 SOD、 CAT 活 性和 GSH 含量， 增强晶状体的抗氧化能力， 减少晶状体的氧化损伤， 防治白内障。 0112 实施例 8 0113 0114 制备方法 ： 按上述比例将山楂叶 70% 乙醇提取物、 乳糖和玉米淀粉混和， 过 200 目 筛， 用水均匀润湿， 把润湿后的混合物干燥再过筛， 加入硬脂酸镁， 然后将混合物压片即得。 0115 实施例 9 0116 胶囊剂 ： 实施例 1 所述山楂叶 70% 乙醇提取物 20mg 0117 半乳糖 188mg

30、0118 硬脂酸镁 2mg 说 明 书 CN 102697901 A 9 8/8 页 10 0119 制备方法 ： 按上述比例将山楂叶 70% 乙醇提取物与半乳糖、 硬脂酸镁均匀混合， 过 200 目筛， 把得到的混合物装入 1 号胶囊， 即得。 0120 实施例 10 0121 口服液 ： 实施例 1 所述山楂叶 70% 乙醇提取物 2g 0122 将配方量山楂叶70%乙醇提取物加入400毫升蒸馏水中溶解， 滤过， 加入适量单糖 浆、 苯甲酸钠， 再加蒸馏水至 1000 毫升， 冷藏， 滤过， 封装于 10 毫升安瓿中， 100灭菌 30 分 钟， 即得。 0123 实施例 11 0124 颗粒剂 ： 实施例 1 所述山楂叶 70% 乙醇提取物 1000mg 0125 将配方量山楂叶 70% 乙醇提取物加入 600g 蔗糖中， 混合均匀， 过 200 目筛， 80% 乙 醇软材， 制粒， 干燥， 6g/ 袋。 0126 上述参照具体实施方式对该山楂叶的新用途进行的详细描述， 是说明性的而不是 限定性的， 可按照所限定范围列举出若干个实施例， 因此在不脱离本发明总体构思下的变 化和修改， 应属本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 102697901 A 10 1/1 页 11 图 1A 图 1B 说 明 书 附 图 CN 102697901 A 11