单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料的制备方法.pdf

1、10申请公布号CN104151372A43申请公布日20141119CN104151372A21申请号201410368540522申请日20140730C07H15/10200601C07H1/0020060171申请人湖南利诺生物药业有限公司地址424400湖南省郴州市桂阳县工业园芙蓉项目区72发明人钏助胜彭亚琦74专利代理机构郴州大天知识产权事务所普通合伙43212代理人徐起堂54发明名称单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料的制备方法57摘要本发明公开了一种单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料的制备方法，包括如下步骤A取冻存新鲜猪脑，解冻，清洗，匀浆，将浆液加入浓盐酸搅匀、然后离心分离，

2、即得沉淀脑蛋白；B将沉淀蛋白加入甲醇进行匀浆，然后搅拌，离心过滤，即得醇提液；C将醇提液浓缩，得醇提浓缩液；D将经上述步骤得到的醇提浓缩液，水解，然后离心分离，收集上清液，即得水解液；E将水解液连续多次循环超滤，截留分子量为1600道尔顿以上的物质，得GM1的初纯品，再将GM1的初纯品超滤，去除分子量为1500道尔顿以下的物质，既得GM1溶液纯品；F将GM1溶液纯品干燥，即得单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料。51INTCL权利要求书1页说明书5页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图1页10申请公布号CN104151372ACN10415137

3、2A1/1页21一种单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料的制备方法，其特征在于包括如下步骤A取冻存新鲜猪脑，解冻，清洗，匀浆，将浆液加入浓盐酸搅匀、然后离心分离，去除上层乳浊液，收集沉淀物，即得沉淀脑蛋白；B将经上述步骤得到的沉淀蛋白加入甲醇进行匀浆，再用氢氧化钠调PH值为79，然后搅拌，离心过滤，收集上清液，即得醇提液；C将经上述步骤得到的醇提液浓缩，得醇提浓缩液；D将经上述步骤得到的醇提浓缩液，调PH值为25，水解，然后离心分离，收集上清液，即得水解液；E将经上述步骤所得水解液连续多次循环超滤，截留分子量为1600道尔顿以上的物质，得GM1的初纯品，再将GM1的初纯品超滤，去除分子量为15

4、00道尔顿以下的物质，既得GM1溶液纯品；F将经上述步骤所得GM1溶液纯品干燥，即得单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料。2根据权利要求1所述单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料的制备方法，其特征在于所述A步骤，取冻存新鲜猪脑，加水浸泡自然解冻，再用水清洗，然后加入猪脑重25倍重量的纯化水用胶体磨匀浆10MIN，将匀浆所得浆液倒入提取罐中加热至8085后保温1020MIN，再按猪脑重每1KG加入25ML的比例加入浓度为12MOL/L的浓盐酸搅匀、冷却至2050，再以35004000R/MIN的速度离心分离5MIN，然后去除上层乳浊液，收集沉淀物，即得纯化脑蛋白。3根据权利要求1所述单唾液酸四已

5、糖神经节苷脂钠GM1原料的制备方法，其特征在于所述B步骤，将经A步骤所得纯化蛋白按猪脑重量36倍的比例加入浓度为7595的甲醇，胶体磨匀浆1次，倒入提取罐中，用6MOL/L氢氧化钠调PH值为79，加热保温至4060搅拌38H，再以35004000R/MIN的速度离心分离5MIN，弃沉淀，收集上清液，即得醇提液。4根据权利要求1所述单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料的制备方法，其特征在于所述C步骤，将经B步骤所得醇提液，6080条件下真空减压浓缩至猪脑重量的1/31/5，即得醇提浓缩液。5根据权利要求1所述单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料的制备方法，其特征在于所述D步骤，将经C步骤所得醇提

6、浓缩液，用6MOL/L盐酸溶液调PH值为25，6080条件下水解35H，然后冷却至2050，以35004000R/MIN的速度离心分离5MIN，弃沉淀，收集上清液，再用6MOL/L氢氧化钠溶液调PH值为78，即得水解液。6根据权利要求1所述单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料的制备方法，其特征在于所述E步骤，将D步骤所得水解液置于能截留分子量为1600道尔顿的中空纤维超滤膜内进行连续多次循环超滤，截留分子量为1600道尔顿以上的物质，得GM1的初纯品，再将GM1的初纯品置于能够截留分子量为1500道尔顿的中空纤维超滤膜中超滤，去除分子量为1500道尔顿以下的物质，得GM1溶液纯品。7根据权利要

7、求1所述单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料的制备方法，其特征在于所述F步骤，将E步骤所得GM1溶液纯品以60冷冻干燥或喷雾干燥，即得单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料。权利要求书CN104151372A1/5页3单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料的制备方法技术领域0001本发明涉及一种单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料的制备方法。背景技术0002单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1广泛存在于哺乳类动物大脑细胞膜表面和中枢神经组织中。单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1对神经系统损伤后的修复、促进神经的生长和再生、促进神经支配功能的恢复、保护神经细胞膜等都有积极的作用。0003目前获取单唾液酸四

8、已糖神经节苷脂钠GM1的方法是从动物脑组织中提取分离。然而，神经节苷脂种类多，在脑组织中含量少，特别是其分子组成、结构物理化学性质等因素十分相近，所以高纯度GM1的提取分离难度大，特别是大规模工业化提取工艺还未见有报道和应用。到目前为止，国内GM1提取分离的工艺主要有MOMOIT方法和利用微生物转化的方法或者用硅胶柱从混合神经节苷脂中分离，成本太高，难以大规模应用于临床，操作步骤繁琐、工艺复杂、并消耗大量有机溶剂，提取的GM1含量仅为脑组织含量的万分之一，而且纯度不高、仅为99。0004本领域技术人员渴望获得一种成本低、纯度更高、能大规模工业化提取的单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料，但一直

9、没有解决这个技术问题。发明内容0005本发明要解决的技术问题就是提供一种成本低、纯度更高、适于大规模工业化应用的单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料的制备方法。0006为了解决上述技术问题，本发明的单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料的制备方法，包括如下步骤A取冻存新鲜猪脑，解冻，清洗，匀浆，将浆液加入浓盐酸搅匀、然后离心分离，去除上层乳浊液，收集沉淀物，即得沉淀脑蛋白；B将经上述步骤得到的沉淀蛋白加入甲醇进行匀浆，再用氢氧化钠调PH值为79，然后搅拌，离心过滤，收集上清液，即得醇提液；C将经上述步骤得到的醇提液浓缩，得醇提浓缩液；D将经上述步骤得到的醇提浓缩液，调PH值为25，水解，然后离心

10、分离，收集上清液，即得水解液；E将经上述步骤所得水解液连续多次循环超滤，截留分子量为1600道尔顿以上的物质，得GM1的初纯品，再将GM1的初纯品超滤，去除分子量为1500道尔顿以下的物质，既得GM1溶液纯品；F将经上述步骤所得GM1溶液纯品干燥，即得单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料。0007进一步改进，所述A步骤，取冻存新鲜猪脑，加水浸泡自然解冻，再用水清洗，然后加入猪脑重25倍重量的纯化水用胶体磨匀浆10MIN，将匀浆所得浆液倒入提取罐中加热说明书CN104151372A2/5页4至8085后保温1020MIN，再按猪脑重每1KG加入25ML的比例加入浓度为12MOL/L的浓盐酸搅匀、

11、冷却至2050，再以35004000R/MIN的速度离心分离5MIN，然后去除上层乳浊液，收集沉淀物，即得纯化脑蛋白。0008进一步改进，所述B步骤，将经A步骤所得纯化蛋白按猪脑重量36倍的比例加入浓度为7595的甲醇，胶体磨匀浆1次，倒入提取罐中，用6MOL/L氢氧化钠调PH值为79，加热保温至4060搅拌38H，再以35004000R/MIN的速度离心分离5MIN，弃沉淀，收集上清液，即得醇提液。0009进一步改进，所述C步骤，将经B步骤所得醇提液，6080条件下真空减压浓缩至猪脑重量的1/31/5，即得醇提浓缩液。0010进一步改进，所述D步骤，将经C步骤所得醇提浓缩液，用6MOL/L盐

12、酸溶液调PH值为25，6080条件下水解35H，然后冷却至2050，以35004000R/MIN的速度离心分离5MIN，弃沉淀，收集上清液，再用6MOL/L氢氧化钠溶液调PH值为78，即得水解液。0011进一步改进，所述E步骤，将D步骤所得水解液置于能截留分子量为1600道尔顿的中空纤维超滤膜内进行连续多次循环超滤，截留分子量为1600道尔顿以上的物质，得GM1的初纯品，再将GM1的初纯品置于能够截留分子量为1500道尔顿的中空纤维超滤膜中超滤，去除分子量为1500道尔顿以下的物质，得GM1溶液纯品。0012进一步改进，所述F步骤，将E步骤所得GM1溶液纯品以60冷冻干燥或喷雾干燥，即得单唾液

13、酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料。0013本发明的方法利用PH梯度的极性有机溶剂少量的甲醇，经调整PH值和温度、能高效地将GM1从猪脑组织中经过纯化蛋白、醇提、浓缩、水解、提纯、干燥步骤处理，所提取的GM1含量达到猪脑组织含量的千分之一，纯度可达999以上，详见附图，其各项质量指标都符合相关标准要求；且有机溶剂用量少、工艺简单、周期短，因而成本低。0014本发明的方法简单可控，能适用于大批量制备单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料，能够一次性处理大量猪脑组织，纯化量大，可以进行规模化生产，适于大规模工业化应用。0015采用本发明的方法制备的单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料可以用于制备医用注射

14、液、冻干粉针及口服制剂等。附图说明0016图1是本发明方法制备的单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料的GM1含量HPLC色谱图。具体实施方式0017下面详细说明本发明方法的实施方式，但不仅限于以下实施例。0018实施例一本发明的单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料的制备方法包括如下步骤A取冻存新鲜猪脑50KG，加水浸泡自然解冻，再用水清洗，然后加入100KG纯化水用胶体磨匀浆10MIN，将匀浆所得浆液倒入提取罐中加热至80后保温10MIN，再加入150ML的比例加入浓度为12MOL/L的浓盐酸搅匀、冷却至20，再以3500R/MIN的速度离心分离说明书CN104151372A3/5页55MIN

15、，然后去除上层乳浊液，收集沉淀物，即得纯化脑蛋白；B将经A步骤所得纯化蛋白加入150KG浓度为75的甲醇，胶体磨匀浆1次，倒入提取罐中，用6MOL/L氢氧化钠调PH值为7，加热保温至40搅拌3H，再以3500R/MIN的速度离心分离5MIN，弃沉淀，收集上清液，即得醇提液；C将经B步骤所得醇提液，60条件下真空减压浓缩至17KG，即得醇提浓缩液；D将经C步骤所得醇提浓缩液，用6MOL/L盐酸溶液调PH值为2，60条件下水解3H，然后冷却至20，以3500R/MIN的速度离心分离5MIN，弃沉淀，收集上清液，用6MOL/L氢氧化钠溶液调PH75，即得水解液；E将D步骤所得水解液置于能截留分子量为

16、1600道尔顿的中空纤维超滤膜内进行连续5次循环超滤，截留分子量为1600道尔顿以上的物质，得GM1的初纯品，再将GM1的初纯品置于能够截留分子量为1500道尔顿的中空纤维超滤膜中超滤，去除分子量为1500道尔顿以下的物质，得GM1溶液纯品；F将E步骤所得GM1溶液纯品置于冷冻干燥机中以60冷冻干燥，即得单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料。0019实施例二A取冻存新鲜猪脑50KG，加水浸泡自然解冻，再用水清洗，然后加入100KG纯化水用胶体磨匀浆10MIN，将匀浆所得浆液倒入提取罐中加热至85后保温15MIN，再加入250ML的比例加入浓度为12MOL/L的浓盐酸搅匀、冷却至35，再以380

17、0R/MIN的速度离心分离5MIN，然后去除上层乳浊液，收集沉淀物，即得纯化脑蛋白；B将经A步骤所得纯化蛋白加入250KG浓度为75的甲醇，胶体磨匀浆1次、10MIN，倒入提取罐中，用6MOL/L氢氧化钠调PH值为85，加热保温至52搅拌6H，再以3800R/MIN的速度离心分离5MIN，弃沉淀，收集上清液，即得醇提液；C将经B步骤所得醇提液，70条件下真空减压浓缩至125KG，即得醇提浓缩液；D将经C步骤所得醇提浓缩液，用6MOL/L盐酸溶液调PH值为35，75条件下水解4H，然后冷却至30，以3800R/MIN的速度离心分离5MIN，弃沉淀，收集上清液，用6MOL/L氢氧化钠溶液调PH76

18、，即得水解液；E将D步骤所得水解液置于能截留分子量为1600道尔顿的中空纤维超滤膜内进行连续6次循环超滤，截留分子量为1600道尔顿以上的物质，得GM1的初纯品，再将GM1的初纯品置于能够截留分子量为1500道尔顿的中空纤维超滤膜中超滤，去除分子量为1500道尔顿以下的物质，得GM1溶液纯品；F将E步骤所得GM1溶液纯品置于冷冻干燥机中以60冷冻干燥，即得单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料。0020实施例三A取冻存新鲜猪脑50KG，加水浸泡自然解冻，再用水清洗，然后加入200KG纯化水用胶体磨匀浆10MIN，将匀浆所得浆液倒入提取罐中加热至85后保温20MIN，再加入250ML的比例加入浓度

19、为12MOL/L的浓盐酸搅匀、冷却至50，再以4000R/MIN的速度离心分离5MIN，然后去除上层乳浊液，收集沉淀物，即得纯化脑蛋白；B将经A步骤所得纯化蛋白加入300KG浓度为95的甲醇，胶体磨匀浆1次、10MIN，倒入提取罐中，用6MOL/L氢氧化钠调PH值为9，加热保温至60搅拌8H，再以4000R/MIN说明书CN104151372A4/5页6的速度离心分离5MIN，弃沉淀，收集上清液，即得醇提液；C将经B步骤所得醇提液，80条件下真空减压浓缩至10KG，即得醇提浓缩液；D将经C步骤所得醇提浓缩液，用6MOL/L盐酸溶液调PH值为38，80条件下水解5H，然后冷却至50，以4000R

20、/MIN的速度离心分离5MIN，弃沉淀，收集上清液，用6MOL/L氢氧化钠溶液调PH75，即得水解液；E将D步骤所得水解液置于能截留分子量为1600道尔顿的中空纤维超滤膜内进行连续6次循环超滤，截留分子量为1600道尔顿以上的物质，得GM1的初纯品，再将GM1的初纯品置于能够截留分子量为1500道尔顿的中空纤维超滤膜中超滤，去除分子量为1500道尔顿以下的物质，得GM1溶液纯品；F将E步骤所得GM1溶液纯品置于喷雾干燥机以180喷雾干燥，即得单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料。0021上述例举了3个典型的实施例，但不限于这些实施例。申请人经过反复试验得到本发明的方法，方法简单可控，并按照该方法进行了反复的试验，所制备的单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料都符合相关标准要求，试验数据详见下表。说明书CN104151372A5/5页7说明书CN104151372A1/1页8图1说明书附图CN104151372A