抗HCMVPP65蛋白单克隆抗体的制备方法及其应用.pdf

1、10申请公布号CN104086651A43申请公布日20141008CN104086651A21申请号201410313847522申请日20140703CCTCCNOC20147620140521C07K16/08200601C12N5/20200601G01N33/577200601G01N33/56920060171申请人湖南师范大学地址410081湖南省长沙市岳麓区麓山南路二里半36号72发明人刘如石邱义兰许凤廖旻晶邱果李桑李烨刘胜姿74专利代理机构北京知本村知识产权代理事务所11039代理人刘江良54发明名称抗HCMVPP65蛋白单克隆抗体的制备方法及其应用57摘要本发明公开了一种高

2、特异性和高亲和力的抗PP65单克隆抗体，其由抗PP65单克隆抗体的杂交瘤细胞株8D6所产生，所述细胞株8D6保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNOC201476。本发明杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有良好的亲和力和特异性，而且该抗体的免疫反应性和特异性优于国内和进口的单抗。本发明该抗体具有作为血液白细胞免疫荧光细胞化学诊断、免疫荧光定量PCR检测HCMV感染的关键原料，也可作为双抗体夹心法检测HCMV的关键原料，对建立HCMV感染快速灵敏的临床诊断试剂具有重要意义，具有重要的应用前景。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书7页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局1

3、2发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图4页10申请公布号CN104086651ACN104086651A1/1页21一株高特异性和高亲和力的抗PP65单克隆抗体，其特征在于其由抗PP65单克隆抗体的杂交瘤细胞株8D6所产生，所述细胞株8D6保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNOC201476。2分泌高特异性和高亲和力抗PP65单克隆抗体的杂交瘤细胞株8D6，所述细胞株8D6保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNOC201476。3一种制备高特异性和高亲和力的抗PP65单克隆抗体的方法，其特征在于，其以HCMVPP65为抗原，制备杂交瘤细胞，获得单克隆抗体。4一种检

4、测人类巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于其包括如权利要求1所述的抗PP65单克隆抗体作为检测抗体。权利要求书CN104086651A1/7页3抗HCMVPP65蛋白单克隆抗体的制备方法及其应用技术领域0001本发明属于领域基因工程领域，具体涉及抗HCMVPP65蛋白单克隆抗体的制备方法及其应用。背景技术0002人类巨细胞病毒（HUMANCYTOMEGALOVIRUS，HCMV）是一种核酸大小约235KB的双链DNA病毒，属疱疹病毒科属。HCMV感染极为普遍1，可在免疫缺陷个体与新生儿中引起严重的疾病，多数感染者无临床症状，但是母亲孕期感染可以导致胎儿感染，通过血液可以进入各种靶器官，导致多系统脏器

5、损伤（如肺炎、少数为肝炎和脑炎），存活者伴随着神经性耳聋、智力低下及其它神经系统后遗症，对HCMV感染早期进行诊断治疗显得尤为重要。HCMVPP65蛋白是HCMV早期产生的一种结构蛋白，在激活状态的HCMV感染时，PP65抗原于624H内表达于外周血淋巴细胞、单核细胞、多形核白细胞及血管内皮细胞中，这表明PP65蛋白HCMV活动性感染的一项早期指标。因而，HCMVPP65抗原对于HCMV的检测及治疗过程中的监测有着重要意义5。目前PP65抗原血症的检测是国际公认的标准检测方法23，即免疫荧光或免疫酶化学染色检测法，利用HCMV编码蛋白的特异性单克隆抗体直接检测外周血细胞中的HCMVPP65抗原

6、4。但是，但该方法目前尚缺乏统一质控标准，并且在检测过程中易受主观因素的影响，限制了其在临床上的应用。另外目前HCMV诊断试剂盒质量参差不齐，也给HCMV的预防和诊治造成严重障碍。0003HCMV是全世界最常见的一种能够引发先天性感染的病毒，在我国成年人感染高达60100，即使在发达国家，人群感染率也高达4060。其感染可使免疫功能不成熟或缺陷的病人发生严重疾病，如HIV病人感染会加速其免疫系统功能性损害从而导致病人死亡；HCMV感染也是导致器官移植患者出现感染并发症，导致器官移植的失败；HCMV也是引起先天性及围生期感染的主要病原体，可以造成流产、早产、胎儿宫内发育迟缓、新生儿头小畸形、肝脾

7、肿大等多器官不可逆损害。因此，HCMV引发了严重的公共卫生问题，在目前尚没有有效的HCMV疫苗上市时，预防成为防止HCMV传播的主要手段。0004目前的研究表明，HCMVPP65是被膜蛋白中最主要的一种，位于病毒的衣壳与包膜之间，占皮层蛋白致密颗粒的95，是一种低基质的磷酸化蛋白6，属于即刻早期蛋白，通常在病毒感染细胞34H即开始合成，并于624H内在外周血多形核白细胞中大量表达78，同时HCMVPP65具有高度保守性，与其他的孢疹病毒无同源性，广泛表达于感染性和非感染性的病毒颗粒中，而且HCMV感染病人血清中几乎均能够检出，因而，HCMVPP65蛋白成为HCMV感染诊断的重要标志物。早期检测

8、到活动性HCMV感染是治疗的先决条件，目前HCMV抗原血症的检测是快速诊断HCMV感染的重要方法。0005国内对HCMV感染的诊断主要采用以全病毒为抗原的间接ELISA法9，可由于HCMV分子量大，结构复杂，且与其他疱疹病毒有交叉反应，因此以完整病毒作为抗原的特异性差。而HCMVPP65抗原是病毒复制过程中出现的早期蛋白，因此，通过检测PP65来判定病毒感染是临床上发现病毒血症的主要方法，其是多克隆抗体10。而目前我国诊断说明书CN104086651A2/7页4HCMV感染的关键原料主要依赖进口，造成诊断试剂价格高昂，给病人造成了沉重的负担。0006参考文献1SIMONAM,ROSARIAS,

9、STEFANIAM,ETALCOMPARISONOFREALTIMEPCRANDPP65ANTIGENASSAYSFORMONITORINGTHEDEVELOPMENTOFCYTOMEGALOVIRUSDISEASEINRECIPIENTSOFSOLIDORGANANDBONEMARROWTRANSPLANTSJNEWMICROBIOL,2011,341571642MOSESS,MALATHIJ,ETALDETERMINATIONOFHUMANCYTOMEGALOVIRUSPP65ANTIGENEMIAAMONGRENALTRANSPLANTPATIENTSJINDIANJNEPHROL201

10、2,2253473523EMERSONC,JACYRP,ANAP,ETALCOMPARISONOFARAPIDCYTOMEGALOVIRUSPP65ANTIGENEMIAASSAYREVEALEDBYIMMUNOFLUORESCENCETOANINHOUSEASSAYREVEALEDBYIMMUNOPEROXIDASEFORDIAGNOSISINSOLIDORGANTRANSPLANTRECIPIENTPATIENTSJBRAZJINFECTDIS20101433223244SARACINOA,COLUCCIR,LATORRACAA,ETALTHEEFFECTSOFPREEMPTIVETHER

11、APYUSINGAVERYLOWTHRESHOLDOFPP65ANTIGENEMIATOPREVENTCYTOMEGALOVIRUSDISEASEINKIDNEYTRANSPLANTRECIPIENTSASINGLECENTEREXPERIENCEJTRANSPLANTPROC2013,4511821845GIMENOC,SOLANOC,LATORREJC,ETALQUANTICATIONOFDNAINPLASMABYANAUTOMATEDREALTIMEPCRASSAYCYTOMEGALOVIRUSPCRKITFORSURVEILLANCEOFACTIVECYTOMEGALOVIRUSINF

12、ECTIONANDGUIDANCEOFPREEMPTIVETHERAPYFORALLOGENEICHEMATOPOIETICSTEMCELLTRANSPLANTRECIPIENTSJJCLINMICROBIOL2008,4610331186CHEVILLOTTEM,LANDWEHRS,LINTAL,ETALMAJORTEGUMENTPROTEINPP65OFHUMANCYTOMEGALOVIRUSISREQUIREDFORTHEINCORPORATIONOFPUL69ANDPUL97INTOTHEVIRUSPARTICLEANDFORVIRALGROWTHINMACROPHAGESJJVIRO

13、L2009,836248024907JOHNPTHUMANCYTOMEGALOVIRUSTEGUMENTPROTEINSPP65,PP71,PP150,PP28JVIROLJ,2012,922238高荣保,王明丽,陈敬贤人巨细胞病毒潜伏感染的研究进展J国外医学病毒学分册,2005,1233733769KONDOK,KANESHIMAH,MOCARSKIESHUMANCYTOMEGALOVIRUSLATENTINFECTIONOFGRANULOCYTEMACROPHAYEPROGENITORSJPROCNATLACADSCIUSA,1994,91251187911883。000710李长贵，王剑

14、锋，英志芳，等以重组人巨细胞病毒PP65制备的多克隆抗体建立检测感染性病毒颗粒方法J中国生物工程杂志,2005,25104749。发明内容0008针对现有技术的不足，本发明在克隆了HCMV病毒株PP65全长基因并在大肠杆菌表达该蛋白的基础上，进一步将重组蛋白免疫动物，从阳性克隆中筛选到了一株高特异说明书CN104086651A3/7页5性和高亲和力的抗PP65单克隆抗体，而且该抗体的免疫反应性和特异性优于国内和进口的单抗，实验证据表明，该抗体具有作为血液白细胞免疫荧光细胞化学诊断、免疫荧光定量PCR检测HCMV感染的关键原料，也可作为双抗体夹心法检测HCMV的关键原料。0009本发明所提供的技

15、术方案是一株高特异性和高亲和力的抗PP65单克隆抗体，其由抗PP65单克隆抗体的杂交瘤细胞株8D6所产生，所述细胞株8D6已于2014年5月21日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC）（保藏地址是湖北省武汉市武汉大学，邮编430072），保藏号为CCTCCNOC201476，经检测存活。0010本发明还提供分泌高特异性和高亲和力抗PP65单克隆抗体的杂交瘤细胞株8D6，所述细胞株8D6保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNOC201476。0011本发明还提供一种制备高特异性和高亲和力的抗PP65单克隆抗体的方法，其以HCMVPP65为抗原，制备杂交瘤细胞，获得单克隆抗体。00

16、12本发明还提供一种检测人类巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于其包括如权利要求1所述的抗PP65单克隆抗体作为检测抗体。0013本发明为了获得抗HCMVPP65蛋白单克隆抗体，作为临床免疫检测HCMV感染的关键医药原料，采用重组表达的HCMVPP65蛋白片段免疫BALB/C小鼠，将免疫淋巴结细胞与SP2/0细胞融合，采用间接ELISA法筛选阳性克隆与效价测定，再用WESTERNBLOTTING进行抗体特异性鉴定，最后用免疫荧光法评价其应用价值。通过大量筛选，最终获得了1株能稳定分泌高亲和力和高特异性抗HCMVPP65的杂交瘤细胞株，命名为8D6。WESTERNBLOTTING及间接ELISA检测其

17、效价分别达14000和1105，免疫荧光实验结果说明，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有良好的亲和力和特异性，实验数据表明该抗体的免疫反应性和特异性优于国内和进口的单抗。实验证据表明，该抗体具有作为血液白细胞免疫荧光细胞化学诊断、免疫荧光定量PCR检测HCMV感染的关键原料，也可作为双抗体夹心法检测HCMV的关键原料，对建立HCMV感染快速灵敏的临床诊断试剂具有重要意义，为建立HCMV感染临床检测方法奠定了基础，具有重要的应用前景。0014附图说明0015图1图1融合细胞生长状况（100）。A融合后第一天的杂交瘤细胞生长状况；B融合后第三天的杂交瘤细胞生长状况；C融合后第十天的杂交瘤细胞生长状

18、况。0016图2抗体的亲和层析纯化与SDSPAGE鉴定。A抗体亲和层析图，B纯化抗体SDSPAGE鉴定（LANEM蛋白质相对分子质量标准，LANE1纯化前腹水，LANE2硫酸胺沉淀纯化抗体，LANE3PROTEINA亲和纯化抗体）。0017图3条带WESTERNBLOTTING比较免疫反应鉴定纯化后的单克隆抗体。CK阴性对照，转化空载体的大肠杆菌BL21诱导后总蛋白；LANE1重组PP65BL21菌株诱导后总蛋白；LANE2重组纯化PP65蛋白；LANE31型人疱疹病毒裂解液；LANE4HCMV病毒裂解液总蛋白；LANE5HCMV病毒裂解后纯化PP65蛋白；LANE6标准品PP65蛋白。001

19、8图4WESTERNBLOT检测单克隆抗体8D6的效价。LANECK阴性对照（未加一抗）；LANE18单克隆抗体8D6分别经1102、5102、1103、2103、4103、8103、1104、2104倍稀释后；LANE9阳性对照（抗PP65单克隆抗体标准品）。说明书CN104086651A4/7页60019图5间接ELISA检测单克隆抗体的效价。0020图6免疫荧光检验制备抗体与感染HCMV的免疫反应性（100）。A和A分别为B和B的阴性对照（不加一抗）；其中A1，B1，A1,和B1为不用激光激发直接在可见光下观察的细胞，A2，B2，A2,和B2为激发荧光后观察到的结果，B2的一抗为8D6，

20、B2是以制备的其它抗体为一抗。0021图7免疫荧光检验制备抗体与感染HCMV的免疫反应性（100）。A和A分别为B和B的阴性对照（不加一抗）；其中A1，B1，A1,和B1为不用激光激发直接在可见光下观察的细胞，A2，B2，A2,和B2为激发荧光后观察到的结果，B2的一抗为8D6，B2的一抗为进口对照标准抗体。0022具体实施方式0023下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。0024材料和主要试剂如下动物和细胞株SP2/0小鼠骨髓瘤细胞由厦门大学公共卫生学院夏宁邵教授惠赠，人肺胚成纤维细胞由本实验室保存，BALB/C雌性小鼠购自中南大学湘雅医学

21、院。0025主要试剂PTOT7、标准抗PP65单克隆抗体由湖南康润药业有限公司惠赠、标准重组PP65蛋白购自美国PROSPEC公司，IPTG羊抗鼠购自康为试剂公司，HRP羊抗鼠由厦门大学公共卫生学院夏宁邵教授惠赠，蛋白质相对分子质量标准购自GENESTAR公司，HRPDAB底物显色试剂盒购自TIANGEN公司，PEG1500、HT和HAT培养基购自SIGMA公司，1640培养基购自GIBCO公司。0026实施例一动物免疫与血清效价检测PP65蛋白足底板免疫小鼠将纯化后的PP65蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化，采用足底板免疫方法，以每只100G的剂量免疫3只68周龄BALB/C雌性小鼠。两周后将PP

22、65重组蛋白与弗氏不完全佐剂充分乳化，采用同样的剂量和方法加强免疫BALB/C小鼠。每次免疫前1D采集小鼠血清，间接ELISA方法检测血清中抗体效价。融合前3D用不加佐剂的PP65重组蛋白免疫足底板，每只剂量为100G。所采血液15稀释于生理盐水中，然后将血悬液置于372H，再移至4过夜，待血球凝集后4000G离心10MIN，吸取上清液即所得抗血清，间接ELISA法检测血清效价，选取血清效价大于1106的小鼠进行细胞融合试验。0027小鼠经过足底板免疫三次后，分别收集免疫前后血清，然后按110，1102，1103，1104，1105，1106进行梯度稀释，然后进行间接ELISA测定，小鼠在初次

23、免疫后体内IGG抗体水平很低，在第1次加强免疫后血清即阳转（以阴性值的21倍设为CUTOFF值），说明了PP65重组蛋白具有良好的免疫原性，能在小鼠体内引起较强的免疫反应，在第3次免疫之后，百万倍稀释后血清中IGG效价已高达10以上（表1），此时免疫后的小鼠可用于后续试验。0028表1间接ELISA检测小鼠血清中抗体效价说明书CN104086651A5/7页7实施例二细胞融合、阳性杂交瘤细胞筛选与亚克隆选择生长状态良好的SP2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠淋巴结细胞分别用无血清培养基洗涤3次后，以15110混合，1500G离心5MIN，弃上清。轻摇离心管使细胞均匀分散后，缓缓加入1ML37预热的PE

24、G1500并轻轻混匀，然后加入20ML1640培养基。800G离心5MIN后弃上清，加入20FBSHAT1640培养基悬浮细胞并混匀。0029将混匀后的细胞均匀铺于96孔板中，置于37，5CO2的培养箱中培养，每天跟踪观察，融合后710D用10FBSHT1640培养液换液，待克隆长至孔底面积的1/31/2时用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清液中抗体，选择阳性值高且细胞集落数目少的孔，通过有限稀释法进行克隆化。0030SP2/0细胞与免疫小鼠淋巴细胞融合后，可见融合细胞体积大，圆形及透亮，背景中存在大量体积小的未融合细胞（图1A，经HAT选择培养后，第2D便有未融合细胞相继死亡，培养35D时

25、即有小克隆出现（图1B，第10D时，克隆已长至孔底面积的约1/3（图1C，每孔含1个或数个细胞克隆，通过观察计数及间接ELISA，得出杂交瘤细胞的融合率和分泌抗体的阳性率分别为925和819。经过3次亚克隆后，从60多个阳性克隆中筛选到1株能稳定分泌抗HCMVPP65单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为8D6。0031将纯化的PP65蛋白用CB缓冲液（15MMOL/LNA2CO3，35MMOL/LNAHCO3）稀释至浓度为1MG/L，包被96孔ELISA板，4过夜。洗板1次后，加入杂交瘤细胞培养上清液，37孵育30MIN后，洗板5次，加入HRP羊抗鼠二抗，37孵育30MIN，洗板5次，最后加入TM

26、B底物显色剂，37反应10MIN，加入终止液终止反应，450NM/630NM双波长检测。经上述间接ELISA鉴定，确定制备的单克隆抗体中均为IGG2B亚型。0032实施例三单克隆抗体产生与纯化采用小鼠体内诱生腹水方法生产单克隆抗体。取810WBALB/C小鼠，先腹腔注射无菌石蜡油，每只05ML。3D后向腹腔内注入8D6杂交瘤细胞株，调整细胞密度为11062106/ML，每只小鼠腹腔注射05ML细胞悬液。接种细胞712D后可明显看到小鼠腹部膨大，采集腹水后进行纯化。将采集好的腹水先11加入饱和硫酸铵沉淀进行初步纯化，4，12000G离心10MIN，去掉上清，沉淀用一定体积的PBS缓冲液（20MM

27、OL/LNACL，268MMOL/LKCL，10MMOL/LNA2HPO4，176MMOL/LKH2PO4，PH74）溶解后，放入10倍体积的PBS缓冲液透析2次，每次2H。4，8000G离心10MIN，收集上清，然后移至透析袋中透析平衡至20倍体积的BINDINGBUFFER（PROTEINASENOSEKIT中提供），透析抗体用PROTEINA进行亲和层析纯化，SDSPAGE鉴定纯化的效果。说明书CN104086651A6/7页80033透析后的抗体上样于结合缓冲液平衡的PROTEINA亲和层析柱，用3倍柱床体积的结合缓冲液洗涤未结合蛋白，大约1MIN出现穿透峰，再用洗脱缓冲液洗脱单克隆抗

28、体，在11MIN左右8D6被洗脱下来（图2A），收集洗脱抗体，进行SDSPAGE鉴定抗体纯度（图2BLANE3），经PROTEINA亲和纯化后抗体纯度已非常高，在SDSPAGE胶上几乎看不到其他杂蛋白。0034实施例四人巨细胞病毒分离培养、单克隆抗体的特异性、效价鉴定用含10胎牛血清的DMEM培养液培养人胚肺成纤维细胞于10MM培养皿，待细胞长至皿底表面积4050以后，将临床分离的HCMV病毒株感染人胚肺成纤维细胞，感染量为1000PFU/皿，置于5CO2，37细胞培养箱中孵育1H后，换用2小牛血清的DMEM细胞培养液培养，感染培养57D后，待细胞基本上发生病变后，收集含有HCMV的细胞上清液

29、。上清液10000G离心20MIN去细胞碎片，用50饱和硫酸铵沉淀1次，经20MMOL/LPBS透析后获得具有感染性的病毒。0035将巨细胞病毒裂解总蛋白进行10的SDSPAGE，电转移到PVDF膜上（200MA，1H），用脱脂奶TN缓冲液（5脱脂奶，50MMOL/LTRISHCL，150MMOL/LNACL，PH75）封闭2H，TNT缓冲液（50MMOL/LTRISHCL，150MMOL/LNACL，005TWEEN20，PH75）洗膜3次，每次10MIN，然后加入单克隆抗体（脱脂奶12000稀释），室温反应2H，洗膜3次，每次10MIN，加入HRP酶标羊抗鼠二抗（脱脂奶13000稀释），室

30、温反应2H后，TNT洗膜3次，每次10MIN，最后用HRPDAB底物显色试剂盒进行显色。0036将纯化后的PP65蛋白用CB液（15MMOL/LNA2CO3，35MMOL/LNAHCO3）稀释至浓度为1MG/L，包被ELISA96孔板，4过夜，洗板1次后，加入梯度稀释的单克隆抗体（1102,1103,1104,1105,1106），37孵育30MIN后，洗板5次，加入HRP羊抗鼠二抗，37孵育30MIN，洗板5次，最后加入TMB底物显色剂，37反应10MIN，加入终止液终止反应，450NM/630NM双波长检测。将大肠杆菌重组菌株表达总蛋白进行10SDSPAGE，电转移到PVDF膜上（200M

31、A，1H），用脱脂奶TN缓冲液（5脱脂奶，50MMOL/LTRISHCL，150MMOL/LNACL，PH75）封闭2H，TNT缓冲液（50MMOL/LTRISHCL，150MMOL/LNACL，005TWEEN20，PH75）洗膜3次，每次10MIN，然后分别加入单克隆抗体（按1102、5102、1103、2103、4103、8103、1104、2104梯度稀释），室温反应2H，洗膜3次，每次10MIN，加入HRP酶标羊抗鼠二抗（用脱脂奶13000稀释），室温反应2H后，TNT洗膜3次，每次10MIN，最后用HRPDAB底物显色试剂盒显色。0037采用本实验表达的重组PP65蛋白、细胞培养H

32、CMV、1型人疱疹病毒等检验纯化单克隆抗体的免疫反应性和特异性，WESTERNBLOT结果显示，在电泳转膜进行免疫印迹反应后，在各自对应的膜上均有特异性条带出现（图3LANE1,2,4,5），与阳性对照组中条带位置一致（图3LANE6）。抗体不但与重组PP65抗原发生了特异性，而且天然PP65蛋白发生了强的特异性免疫反应，与1型人疱疹病毒以及大肠杆菌中其他蛋白没有任何交叉反应，且阴性对照组中没有任何条带显示（图3LANECK，LANE3），说明了该株抗体具有良好的免疫反应性和特异性抗，具有作为免疫诊断关键原料开发的潜力。0038单克隆抗体8D6梯度稀释后，作为一抗进行条带WESTERNBLOT

33、TING检测，结果显示，抗PP65单克隆抗体在稀释至4000倍时仍能看到明显的特异性条带（图4LANE5），说明书CN104086651A7/7页9经过1104倍稀释后还能看到比较弱的免疫反应目的条带（图4LANE7），说明抗体的亲和力强。将8D6单克隆抗体按梯度稀释后进行间接ELISA检测，结果显示抗体与重组PP65蛋白以及商品化的PP65蛋白免疫反应具有高度灵敏性，其效价均高达1100000（图5），进一步证明了制备的抗PP65单克隆抗体对抗原具有高的亲和力。0039实施例五8D6克抗免疫荧光实验检测将人胚肺成纤维细胞（HEL）用10胎牛血清的DMEM培养液培养至已放置细胞爬片的24孔培养

34、板中，培养HEL细胞，待细胞长至皿底表面积4050以后，将临床分离的HCMV病毒株感染HEL细胞（即将保存的病毒液滴加至生长了HEL的培养皿中），感染量为500PFU/孔，置于5CO2细胞培养箱中37孵育1H，换用2小牛血清的DMEM细胞培养液培养，感染培养57D后，待细胞基本上发生病变后，用镊子小心夹出爬片，PBS洗涤爬片3次，每次5MIN，然后加入4多聚甲醛固定10MIN，接着用PBS洗涤爬片3次，每次5MIN，接着加入透化液（2TRITONX100PBS）作用5MIN，PBS洗涤后加入抗PP65单克隆抗体（11000稀释），25孵育30MIN，PBS洗涤后加入FITC羊抗鼠二抗，25孵育

35、30MIN，PBS洗涤3次，加入抗猝灭剂后置于荧光显微镜下镜检。0040分别取感染病毒的细胞和对照细胞固定在盖玻片上，再用筛选到的8D6单克隆抗体、60株阳性克隆除8D6外的其它抗体、购买的国产与进口标准抗HCMVPP65单克隆抗体进行免疫荧光染色检测，比较抗体的特异性与亲和力。在比较本发明制备的单克隆抗体时发现，所有的抗体均出现了明显的黄绿色阳性信号（图6B2和B2），而在未感染的细胞对照中，则没有阳性荧光细胞出现（图6A2和A2）。而在所有的单克隆抗体中，8D6对应的细胞所发出的荧光最亮，图像清晰且持续的时间长（图6B2），说明8D6具有良好的免疫反应性和高的亲和力，具有作为诊断HCMV感

36、染的关键原料的潜力。0041将8D6进一步与进口抗HCMVPP65单克隆抗体进行免疫荧光试验，图7B2与图7B2分别为单抗8D6和进口单抗作为一抗时的荧光反应，从结果可以发现，本研究制备的8D6单抗作为一抗时，采用免疫荧光检测HCMV感染细胞检测时，其荧光强度和持续时间都优于进口一抗，进一步说明本研究制备的抗HCMVPP65单克隆抗体具有良好的应用前景。说明书CN104086651A1/4页10图1说明书附图CN104086651A102/4页11图2图3说明书附图CN104086651A113/4页12图4图5说明书附图CN104086651A124/4页13图6图7说明书附图CN104086651A13