含有犬GMCSF基因的重组犬瘟热病毒及其制备方法.pdf

1、10申请公布号CN104164409A43申请公布日20141126CN104164409A21申请号201410345409722申请日20140718C12N7/01200601C12N15/74200601C12R1/9320060171申请人中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所地址130122吉林省长春市净月高新技术产业开发区柳莺西路666号72发明人高玉伟冯娜王磊虞一聪李天松王铁成李元果王化磊郑学星赵永坤黄耕杨松涛夏咸柱74专利代理机构北京中誉威圣知识产权代理有限公司11279代理人丛芳54发明名称含有犬GMCSF基因的重组犬瘟热病毒及其制备方法57摘要本发明涉及重组病毒疫苗领

2、域，本发明公开了一种含有编码犬粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的基因的重组犬瘟热病毒，更具体地，重组犬瘟热病毒是RCDVGMCSF。本发明还公开了该重组犬瘟热病毒的制备方法。本发明运用反向遗传学操作技术，将犬GMCSF基因插入犬瘟热病毒的基因组内，构建了含有犬GMCSF基因的重组基因组全长CDNA克隆PCICDVGMCSF，经RTPCR、间接免疫荧光试验、电镜观察证实成功救获了表达GMCSF蛋白的重组犬瘟热病毒RCDVGMCSF，且该重组犬瘟热病毒的生长滴度与野生型犬瘟热病毒无明显差异，为进一步研究GMCSF作为佐剂应用于犬瘟热弱毒疫苗株的免疫奠定了物质基础。51INTCL权利要求书1页说明书22页

3、附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书22页附图3页10申请公布号CN104164409ACN104164409A1/1页21一种重组犬瘟热病毒，其特征在于，所述重组犬瘟热病毒在其基因组中插入犬GMCSF基因。2根据权利1所述的重组犬瘟热病毒，其特征在于，所述重组犬瘟热病毒是由弱毒疫苗株CDV/R20/8构建而成。3根据权利要求1或2所述的重组犬瘟热病毒，其特征在于，所述犬GMCSF基因位于所述犬瘟热病毒中编码磷蛋白基因P和编码基质蛋白基因M之间的非编码区。4根据权利要求1或2所述的重组犬瘟热病毒，其特征在于，所述犬GMCSF基因的核苷酸序列如SEQIDN

4、O1所示。5根据权利要求1或2所述的重组犬瘟热病毒，其特征在于，所述犬GMCSF基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。6一种权利要求1所述的重组犬瘟热病毒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤1构建转录质粒，所述转录质粒包括其中插入犬GMCSF基因的所述犬瘟热病毒的基因组CDNA序列；2构建一个或多个转录辅助质粒，所述转录辅助质粒编码所述犬瘟热病毒的核蛋白N、磷蛋白P、和/或大聚合酶蛋白L；3将所述转录质粒和所述辅助质粒共转染所述犬瘟热病毒复制许可的宿主细胞，培养转染后的所述宿主细胞；4从转染的所述宿主细胞的细胞悬液中拯救所述重组犬瘟热病毒。7根据权利要求6所述的制备方法，

5、其特征在于，所述步骤3的详细过程如下BHK21细胞接种于六孔板中，待第二天生长至7080单层时，采用磷酸钙转染试剂将构建好的转录质粒与辅助质粒共转染BHK21细胞，转染步骤如下1将氯化钙与各质粒混合静置，静置期间将BHK21细胞消化下来，离心，弃掉DMEM；2将BHK21细胞加入氯化钙与质粒混合液中，吹打均匀，静置，静置期间将DMEM置于37温箱孵育；3将新的DMEM加入步骤2得到的混合液中，混匀后加入6孔板；412H后43水浴热激2H；524H后用含有10DMSO的PBS液休克细胞25MIN，之后加入完全DMEM培养液继续于5CO2、37培养箱中培养。8根据权利要求6或7所述的制备方法，其特

6、征在于，所述转录质粒是PCICDVGMCSF。9根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述PCICDVGMCSF的转染量为5G。10根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述转录辅助质粒是三个，所述三个转录辅助质粒分别编码所述犬瘟热病毒的所述核蛋白N、所述磷蛋白P、所述大聚合酶蛋白L。11根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述转录辅助质粒分别是PCICDVN、PCICDVP、PCICDVL。12根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述PCICDVN、所述PCICDVP、所述PCICDVL的转染量分别是1G、08G和05G。13根据权利要求6或7所述的制备方法，其

7、中所述宿主细胞是VERO细胞或BHK细胞。权利要求书CN104164409A1/22页3含有犬GMCSF基因的重组犬瘟热病毒及其制备方法技术领域0001本发明涉及重组病毒疫苗领域，更具体地，本发明涉及一种含有编码犬粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的基因的重组犬瘟热病毒，更具体地，重组犬瘟热病毒是RCDVGMCSF。本发明还公开了该重组犬瘟热病毒的制备方法。背景技术0002犬瘟热是犬瘟热病毒CANINEDISTEMPERVIRUS，CDV引起多种动物的急性、热性、高度接触性和致死性传染病，常引起犬、貂、狐等动物发病，给犬和毛皮经济动物养殖业造成巨大损失，CDV自然感染宿主在不断扩大，除犬科动物外，还可

8、感染大熊猫、小熊猫、狮、虎和豹等食肉目所有8个科、偶蹄目猪科、灵长目的猕猴属和鳍足目海豹科等多种动物。疫苗接种能有效预防该病。0003犬瘟热病毒属于副粘病毒科麻疹病毒属，基因组为非分节段的单股负链RNA，全长15,690个核苷酸，编码6个结构蛋白，依次为核蛋白NP、磷蛋白P、基质蛋白M、融合蛋白F、血凝素蛋白H和大聚合酶蛋白L，负链RNA病毒的主要特点是基因组RNA不具有感染性，而且裸露的基因组RNA本身也不能作为模板，只有在与核蛋白NP结合成核糖核蛋白RNP复合体后，才能作为模板起始复制和转录，并表达和包装出具有感染性的子代病毒。0004粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GRANULOCYTEMAC

9、ROPHAGECOLONYSTIMULATINGFACTOR，GMCSF是一种有广泛免疫活性的效应因子，能刺激粒细胞、单核细胞、T细胞的增殖、分化及功能成熟，激活树突状细胞增强其递呈抗原的能力；增强IL2的产生，活化CD4T细胞，提高其分泌抗体的能力，同时亦可增强CD8T细胞的功能，提高细胞免疫水平。0005犬瘟热的预防免疫主要是通过接种犬瘟热病毒弱毒疫苗进行工动免疫。无论是进口疫苗还是其复制品或国内生产的疫苗，虽有一定的效果，但都不能彻底控制犬瘟热的发生。因此，研发一种能够彻底控制犬瘟热的免疫原性高的病毒疫苗是亟待解决的问题。发明内容0006本发明选用我国临床上广泛应用的犬瘟热病毒弱毒疫苗株

10、，利用反向遗传操作平台，构建了含有犬粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GMCSF基因的重组犬瘟热全长CDNA克隆PCICDVGMCSF。应用构建的全长CDNA克隆，利用反向遗传操作技术救获了重组犬瘟热病毒RCDVGMCSF，该重组病毒与亲本疫苗株的生长特性一致，并且GMCSF蛋白的表达具有遗传稳定性。0007本发明的目的在于提供一种含有编码犬GMCSF蛋白的基因的重组犬瘟热病毒，所述重组犬瘟热病毒为RCDVGMCSF，其基因组序列如SEQIDNO4所示。0008在一个优选实施方案中，通过反向遗传操作技术在犬瘟热病毒弱毒疫苗中表达所述犬GMCSF蛋白，犬瘟热病毒弱毒疫苗优选CDV/R20/8疫苗株。00

11、09在一个优选实施方案中，GMCSF基因位于所述犬瘟热病毒基因组编码的磷蛋白说明书CN104164409A2/22页4P基因和基质蛋白M基因之间的非编码区。0010在一个优选实施方案中，所述编码犬粒细胞巨噬细胞集落刺激因子即GMCSF蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO1所示。0011在一个优选实施方案中，所述犬粒细胞巨噬细胞集落刺激因子即GMCSF蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。0012本发明的另一个目的在于提供本发明的重组犬瘟热病毒的制备方法，该方法包括1构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入编码犬粒细胞巨噬细胞集落刺激因子即GMCSF蛋白的基因的所述犬瘟热病毒的基因组CDNA序列，优选

12、所述犬瘟热弱毒疫苗株是CDV/R20/8；2构建一个或多个转录辅助质粒，该辅助质粒包括编码所述犬瘟热弱毒疫苗的核蛋白NP的CDNA序列、编码所述犬瘟热弱毒疫苗的磷蛋白P的CDNA序列、和编码所述犬瘟热弱毒疫苗的大聚合酶蛋白L的CDNA序列；3将所述转录质粒和辅助质粒共转染所述犬瘟热病毒复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；4从转染的宿主细胞的细胞悬液中拯救重组犬瘟热病毒。0013将所述转录质粒和辅助质粒共转染所述犬瘟热病毒复制许可的宿主细胞的详细步骤如下BHK21细胞接种于六孔板中，待第二天生长至7080单层时，采用磷酸钙转染试剂将构建好的转录质粒与辅助质粒共转染BHK21细胞。转染步骤如

13、下1将氯化钙与各质粒混合静置，静置期间将BHK21细胞消化下来，离心，弃掉DMEM；2将细胞加入氯化钙与质粒混合液中，吹打均匀，静置，静置期间将DMEM置于37温箱孵育；3将新的DMEM加入步骤2的混合液中，混匀后加入6孔板；412H后43水浴热激2H；524H后用含有10DMSO的PBS液休克细胞25MIN，之后加入完全DMEM培养液继续于5CO2、37培养箱中培养。0014在本发明的一个具体的实施方案中，将所述转录质粒和辅助质粒共转染所述犬瘟热病毒复制许可的宿主细胞的操作步骤如下所示BHK21细胞接种于六孔板中，待第二天生长至7080单层时，采用磷酸钙转染试剂将构建好的转录质粒PCICDV

14、GMCSF与辅助质粒PCICDVN、PCICDVP、PCICDVL共转染BHK21细胞，转染量分别为5G、1G、08G和05G。转染步骤如下1将氯化钙与各质粒混合静置，静置期间将BHK21细胞消化下来，800G室温离心5MIN，弃掉DMEM；2将细胞加入氯化钙与质粒混合液中，吹打均匀，静置20MIN，静置期间将5DMEM置于37温箱孵育；3将新的5DMEM加入步骤2的混合液中，混匀后加入6孔板；412H后43水浴热激2H；524H后用含有10DMSO的PBS液休克细胞25MIN，之后加入完全DMEM培养液继续于5CO2、37培养箱中培养。0015在一个优选实施方案中，所述转录质粒是PCICDV

15、GMCSF，所述转录辅助质粒分别是质粒PCICDVN、PCICDVP、PCICDVL。0016在一个优选实施方案中，所述宿主细胞是VERO细胞或BHK细胞。0017具体而言，重组犬瘟热病毒CANINEDISTEMPERVIRUS，CDV作为新型的活病毒载体疫苗具有巨大的优势和应用前景。本研究以犬瘟热弱毒疫苗株CDV/R20/8为亲本株，采用反向遗传操作技术救获了含有犬粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GMCSF基因的重组犬瘟热病毒RCDVGMCSF，常规透射电镜观察病毒粒子形态，结果显示重组病毒RCDVGMCSF具有完整的副粘病毒粒子形态，粒子的大小及形状与母本毒RCDV无明显差异；间接免疫荧光说明书

16、CN104164409A3/22页5证实GMCSF蛋白在重组病毒RCDVGMCSF感染的VERO细胞中获得高效表达；病毒一步生长试验显示，反向遗传救获的RCDV和RCDVGMCSF的生长滴度峰值无明显差异。0018本发明的优点和有益效果如下本发明运用反向遗传学操作技术，将犬GMCSF插入犬瘟热病毒的基因组内，构建了含有犬GMCSF基因的重组基因组全长CDNA克隆PCICDVGMCSF，GMCSF蛋白稳定高效表达，提高了重组犬瘟热病毒的免疫原性。为进一步研究GMCSF作为佐剂应用于犬瘟热弱毒疫苗株的免疫奠定了物质基础。附图说明0019图1含有狂犬病毒糖蛋白G基因重组犬瘟热全长质粒PCICDVRV

17、G图1A；表达犬粒细胞巨噬细胞集落刺激因子即GMCSF基因重组犬瘟热全长质粒PCICDVGMCSF图1B构建其中“斜体大写字母序列”为PMEI酶切位点，“加下划线的小写字母”为基因转录终止信号序列GE，“加下划线的大写字母”为基因转录起始信号序列GS，“大写加粗的CTT”为基因间隔区核苷酸，“斜体加粗的序列GCCACCACC”为KOZAK序列；0020图2重组犬瘟热病毒RCDVGMCSF的RTPCR鉴定结果；0021图3重组犬瘟热病毒RCDVGMCSF感染VERO细胞的间接免疫荧光图片ARCDVGMCSF感染的VERO细胞；B未感染的VERO细胞；0022图4RCDVGMCSF电子显微镜观察图

18、40000；0023图5RCDVGMCSF和RCDV感染VERO细胞的生长动力学曲线；0024图6质粒PBLUESCRIPTIIKS载体图谱；0025图7质粒PCI载体图谱。具体实施方式0026下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例只是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。0027实施例含有编码犬粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GMCSF的基因的重组犬瘟热病毒的构建00281材料和方法002911材料0030犬瘟热弱毒疫苗CDV/R20/8购自中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所，表达狂犬病病毒糖蛋白的重组犬瘟热病毒全长CDNA克隆质粒PCICDVRVG和表达CDVNP、P和L蛋

19、白的辅助质粒PCICDVN、PCICDVP和PCICDVL由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存；BHK21细胞ATCCNOCCL10和VERO细胞ATCCNOCCL81由本研究室保存，培养液均为含10胎牛血清的DMEM；质粒PCIPROMEGA和PBLUESCRIPTIIKSCLONTECH由本研究室保存；PHUSIONDNA聚合酶，T4DNA连接酶及其它限制性内切酶均购自NEB公司；感受态细胞购自TAKARA公司；凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自AXYGEN公司；RNA提取用TRIZOL、鼠源反转录酶MLV、磷酸钙转染试剂盒，RPMI1640培养液购自INVITROGEN；胎牛血清购自长春

20、西诺生物科技有限公司；犬抗CDV全病毒高免血清由本研究室制备；荧光素FITC标记的兔抗犬二抗购自SIGMA公司；荧光显微镜为BX51FL；OLYMPUS，购自OLYMPUS公司；HANKS液，犬淋巴细胞分离液，刀豆蛋白ACONA购自索莱宝说明书CN104164409A4/22页6公司。003112犬GMCSF基因的获取和序列分析0032从GENBANK获得犬GMCSF开放阅读框序列GENBANKACCESSIONNOS49738，设计一对引物见表1，上游引物起始密码子ATG前分别引入了GE、GS和KOZAK序列，并在上下游引物中引入PMEI酶切位点，同时保证全长总碱基数为6的倍数。0033无菌

21、采取比格犬外周血10ML于抗凝采血管，以犬淋巴细胞分离液分离出单核细胞，用HANKS液洗涤后离心收集单核细胞，再用含10胎牛血清、1CONARPMI1640培养液,于37、5CO2条件下培养20H,诱导产生细胞因子,收集诱导培养后的单核细胞。0034使用TRIZOL法提取诱导培养后的单核细胞RNA方法见试剂说明书。提取的RNA溶于DEPC水中，以鼠源反转录酶MLV进行反转录合成CDNA第一条链。以CDNA为模板利用上述引物进行PCR扩增GMCSF基因，经凝胶电泳回收后平端克隆至PBLUESCRIPTIIKS载体ECORV位点，克隆产物经序列测定正确后命名PBGMCSF。0035表1表达犬GMC

22、SF全长基因组克隆质粒构建用引物00360037注“斜体大写字母序列”为PMEI酶切位点，“加下划线的小写字母”为基因转录终止信号序列，“加下划线的大写字母”为基因转录起始信号序列，“大写加粗的CTT”为基因间隔区核苷酸，“斜体加粗的序列GCCACCACC”为KOZAK序列。003813表达犬GMCSF基因的重组病毒基因组全长CDNA克隆的构建0039将12中经测序正确的质粒PBGMCSF用PMEI限制性内切酶消化后回收GMCSF片段，并连接入同样酶切去磷酸化的表达狂犬病病毒糖蛋白的重组犬瘟热病毒全长CDNA克隆质粒PCICDVRVGP基因与M基因之间，构建含有GMCSF的重组基因组全长CDN

23、A克隆PCICDVGMCSF。004014重组病毒的拯救0041BHK21细胞接种于六孔板中，待第二天生长至7080单层时，采用磷酸钙转染试剂将构建好的转录质粒PCICDVGMCSF与辅助质粒PCICDVN、PCICDVP、PCICDVL共转染BHK21细胞，转染量分别为5G、1G、08G和05G。详细的转染步骤如下1将氯化钙与各质粒混合静置，静置期间将BHK21细胞消化下来，800G室温离心5MIN，弃掉DMEM；2将细胞加入氯化钙与质粒混合液中，吹打均匀，静置20MIN，静置期间将5DMEM置于37温箱孵育；3将新的5DMEM加入步骤2的混合液中，混匀后加入6孔说明书CN104164409

24、A5/22页7板；412H后43水浴热激2H；524H后用含有10DMSO的PBS液休克细胞25MIN，之后加入完全DMEM培养液继续于5CO2、37培养箱中培养。4D后刮下细胞，将细胞悬液混匀，取300L细胞悬液接种于生长过夜、密度约6070的单层VERO细胞，感作1H后加入含有5胎牛血清的DMEM，于5CO2、37培养箱中培养46D后，显微镜下观察细胞病变情况，待细胞出现病变时，收获细胞悬液，作为第一代种毒保存于80冰箱。拯救成功的具有感染性的表达GMCSF的重组犬瘟热病毒命名为RCDVGMCSF。004215重组犬瘟热病毒RCDVGMCSFRTPCR鉴定0043分别取拯救重组病毒RCDV

25、GMCSF与母本毒RCDV250L，按TRIZOL法提取基因组RNA，以鼠源反转录酶MLV合成CDNA第一条链，以设计鉴定引物GMCSFJDF5GAAGTTCTCAAGCAGCCC3；GMCSFJDR5CCTACCATCGGGATAAGTGGTA3进行PCR扩增，将扩增产物回收并进行测序分析，以确定拯救重组病毒基因组中含有GMCSF基因。004416重组犬瘟热病毒RCDVGMCSF间接免疫荧光鉴定0045将VERO细胞接种于24孔板中，第二天待细胞生长至7080单层时，以无血清DMEM培养液重组犬瘟热病毒RCDVGMCSF种毒液进行10倍系列稀释，取103倍病毒稀释液接种于24孔板中，接种量为

26、100L/孔。于5CO2、37培养箱中培养3D，弃去培养上清，以PBS缓冲液洗涤细胞两次，室温下以3多聚甲醛固定30MIN，PBST洗涤三遍。以1BSA按1200倍稀释犬抗CDV高免血清为一抗加入24孔板中室温摇床孵育30MIN，PBST洗涤三遍后，加入1200倍稀释FITC标记的羊抗狗荧光二抗，室温摇床作用30MIN，PBST洗涤三遍，荧光显微镜观察检测结果。004617重组病毒RCDVGMCSF电镜观察0047分别收集拯救重组病毒RCDVGMCSF与母本毒RCDV感染VERO细胞上清，采用磷钨酸负染法制备样本，常规透射电镜观察病毒粒子形态。004818重组病毒RCDVGMCSF与母本毒RC

27、DV在VERO细胞上的生长动力学比较0049将救获重组病毒RCDVGMCSF与母本毒RCDV分别按MOI为001接种生长过夜、密度约为7080单层VERO细胞，37感作1H后，PBS洗2次，加入含2胎牛血清的DMEM培养液，5CO2、37继续培养，分别于感染后24H、48H、72H、96H和120H收获上述感染病毒的细胞；将上述不同时间段收获的病毒液冻融1次后，做10倍连续稀释，分别取100L各稀释度病毒液接种铺于24孔板、过夜生长至密度约为7080单层VERO细胞，37感作1H后，加入含2胎牛血清的DMEM培养液，5CO2、37培养，每个稀释度做4个重复；感染后第5天显微镜下观察细胞病变，计

28、算各时间点收取重组病毒RCDVGMCSF与母本毒RCDV病毒滴度TCID50，并绘制病毒生长动力学曲线，以评价两种病毒在VERO细胞上的生长动力学特点。00502结果005121含有犬GMCSF基因的重组CDV基因组全长CDNA克隆的构建0052用TRIZOL法提取的诱导培养后的单核细胞RNA以鼠源反转录酶MLV进行反转录合成CDNA第一条链。以合成的CDNA为模板利用GMCSFF/GMCSFR引物进行PCR扩增获得犬GMCSF基因的片段，大小为500BP。经凝胶电泳回收后克隆至PBLUESCRIPTIIKS载体ECORV位点，测序正确的质粒命名为PBGMCSF。PBGMCSF的序列如SEQI

29、DNO3所示。PBGMCSF用PMEI限制性内切酶消化后回收GMCSF片段，并连接入同样酶切处理的说明书CN104164409A6/22页8PCICDVRVG，构建成含有GMCSF基因的重组基因组全长CDNA克隆PCICDVGMCSF图1。PCICDVGMCSF的序列如SEQIDNO4所示。005322重组病毒的拯救及RTPCR鉴定结果0054为了从CDNA克隆中拯救出感染性RCDVGMCSF，以PCICDVGMCSF及表达犬瘟热病毒N、P和L蛋白辅助质粒PCICDVN、PCICDVP、PCICDVL以磷酸钙试剂盒共转染BHK21细胞，4天后，刮取细胞，将细胞悬液混和均匀记为F1代，取其中30

30、0L悬液接种于单层长至7080VERO细胞，培养46D，显微镜下观察细胞病变，待细胞病变达80时收获病毒记为F2代。按上述方法连续传至F5代。以鉴定引物GMCSFJDF/GMCSFJDR通过RTPCR鉴定结果表明重组病毒RCDVGMCSF可特异地扩增出大小985BP的条带，而母本毒仅扩增出大小为482BP的条带，结果与预期相符。结果表明通过反向遗传操作技术成功救获具有感染性的含有犬GMCSF基因的重组犬瘟热病毒RCDVGMCSF图2。005523间接免疫荧光检测救获的病毒0056为进一步鉴定所救获的重组病毒，以救获的重组病毒RCDVGMCSF进行10倍系列稀释，取103倍病毒稀释液接种于密度约

31、为7080单层VERO细胞，3天后以3多聚甲醛固定细胞，分别以1200倍稀释犬抗CDV高免血清为一抗、1200倍稀释羊抗狗FITC标记抗体为二抗进行间接免疫荧光染色。结果显示，重组犬瘟热病毒RCDVGMCSF感染细胞显示阳性绿色荧光信号图3A，而未感染病毒的VERO细胞则显示阴性荧光信号图3B。结果表明通过反向遗传技术成功救获具有感染性的重组犬瘟热病毒RCDVGMCSF。005724电镜观察检测救获的病毒0058为鉴定上述救获的重组病毒，分别取F3代重组病毒RCDVGMCSF与母本毒RCDV各50L，采用磷钨酸负染法制备样本，常规透射电镜观察病毒粒子形态，结果显示重组病毒RCDVGMCSF图4

32、A具有完整的副粘病毒粒子形态，粒子的大小及形状与母本毒RCDV无明显差异图4B。结果表明通过反向遗传技术成功救获具有感染性的重组犬瘟热病毒RCDVGMCSF。005925重组病毒与母本毒在VERO细胞上的生长动力学比较0060为比较重组病毒RCDVGMCSF和母本毒RCDV在VERO细胞上的生长动力学特点，分别将两种病毒按MOI为001接种于生长过夜、密度约为7080单层VERO细胞，分别于感染后24H、48H、72H、96H和120H收获病毒液，将上述不同时间点收取的病毒冻融一次后，分别作10倍连续稀释后，接种于24孔板中生长过夜、密度约为7080单层VERO细胞，5天后显微镜下观察细胞病变

33、情况，根据REEDMUENCH法计算病毒滴度TCID50。结果显示，重组病毒RCDVGMCSF和母本毒RCDV相比生长滴度达到峰值的时间推迟至72H，但生长滴度峰值无明显差异图5。0061说明书CN104164409A7/22页90062说明书CN104164409A8/22页100063说明书CN104164409A109/22页110064说明书CN104164409A1110/22页120065说明书CN104164409A1211/22页130066说明书CN104164409A1312/22页140067说明书CN104164409A1413/22页150068说明书CN104164

34、409A1514/22页160069说明书CN104164409A1615/22页170070说明书CN104164409A1716/22页180071说明书CN104164409A1817/22页190072说明书CN104164409A1918/22页200073说明书CN104164409A2019/22页210074说明书CN104164409A2120/22页220075说明书CN104164409A2221/22页230076说明书CN104164409A2322/22页24说明书CN104164409A241/3页25图1A图1B图2图3A说明书附图CN104164409A252/3页26图3B图4A图4B图5说明书附图CN104164409A263/3页27图6图7说明书附图CN104164409A27