NEU3在制备防治血管内皮炎症损伤药物中的应用.pdf

1、(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202311688697.1(22)申请日 2024.01.09(71)申请人 重庆医科大学地址 400016 重庆市渝中区医学院路1号重庆医科大学袁家岗校区(72)发明人 卢怡宁于超马丽梅(51)Int.Cl.A61K 45/00(2006.01)A61K 31/713(2006.01)A61P 9/14(2006.01)A61P 29/00(2006.01)A61P 9/10(2006.01)(54)发明名称NEU3在制备防治血管内皮炎症损伤药物中的应用(57)摘要本发明公开了NEU3在制备防

2、治血管内皮炎症损伤药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明研究显示NEU3作为靶点在NEU3基因沉默后，主要下调唾液酸水平，从而抑制内皮炎症损伤，提供了内皮炎症损伤中的重要基因，从而方便开发新的治疗方法，从而从根本上进一步提高内皮炎症损伤的治疗效果，或者实现根除内皮炎症损伤的目的。权利要求书1页 说明书4页 附图2页CN 117503936 A2024.02.06CN 117503936 A1.NEU3在制备防治血管内皮炎症损伤药物中的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，包括以下步骤：S1.NEU3在内皮炎症损伤时上调S2.加入NEU3 siRNA后，NEU3表达水平降低S3.加入

3、NEU3 siRNA后，唾液酸水平降低S4.加入NEU3 siRNA后，内皮炎症损伤水平降低。3.根据权利要求2所述应用，其特征在于,所述S1中内皮炎症损伤模型通过TNF(肿瘤坏死因子)构建。4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述S2中NEU3 siRNA为正义序列为5GGUUGACCUAGGUAUCUAU3，反义序列5AUAGAUACCUAGGUCAACC3。5.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述S3中唾液酸水平通过液相色谱质谱联用(LCMS)检测。6.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述S4中内皮内皮炎症损伤水平的标志性蛋白为VCAM1,ICAM1。7.根据权利要求2所述应

4、用，其特征在于，NEU3作为靶点在制备治疗内皮炎症损伤药物中的应用，加入NEU3 siRNA使其基因沉默后，主要下调唾液酸水平，从而抑制内皮炎症损伤。权利要求书1/1 页2CN 117503936 A2NEU3在制备防治血管内皮炎症损伤药物中的应用技术领域0001本发明属于生物医药技术领域，具体涉及NEU3作为靶点在预防和/或治疗血管内皮炎症损伤药物中的应用。背景技术0002动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种由炎症细胞浸润、内皮功能障碍等因素相互作用下所致的慢性炎症性疾病。而血管内皮完整性破坏被认为是动脉粥样硬化发生与发展的始动环节，因此，探索调控血管内皮损伤机制将对完

5、善AS进展学说提供更多理论依据，为AS诊疗及靶向药物研发提供更多数据支持。0003在对动脉粥样硬化的长期研究中发现，一些与内皮接触的血液中循环代谢物水平水平发生变化，其中唾液酸(sialic acid)含量显著升高，并且有文献报道升高的唾液酸能够通过诱导内皮炎症损伤促进动脉粥样硬化进程。0004NEU3(sialidase 3)是唾液酸剪切酶家族中的一员，负责执行切割糖蛋白末端唾液酸的功能，同时生成的游离唾液酸进入血液发挥其生理作用。而关于NEU3在调控唾液酸参与内皮炎症损伤进程的功能应用还未见报道。发明内容0005本发明的目的是提供一种治疗内皮炎症损伤的新策略以及NEU3在制备防治血管内皮炎

6、症损伤药物中的应用。0006本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：0007本发明研究发现，相对于正常HUVEC，发生炎症损伤后检测到异常的NEU3表达上调。在沉默NEU3，可降低唾液酸及其诱导的内皮炎症损伤水平，表明NEU3可调控唾液酸水平参与内皮炎症损伤进程，可通过抑制NEU3的表达(包括但不限于敲除、沉默、下调等方式)，进而降低唾液酸水平，进而预防和/或治疗血管内皮炎症损伤。0008因此，本发明提供关于NEU3的以下新应用：0009NEU3在调控唾液酸水平中的应用0010NEU3在制备预防和/或治疗血管内皮炎症损伤药物中的应用0011优选的，内皮炎症损伤模型通过TNF(肿瘤坏死因子

7、)构建。0012优选的，所述内皮炎症损伤水平的标志性蛋白为VCAM1,ICAM1。0013优选的，所述唾液酸水平通过液相色谱质谱联用(LCMS)检测。0014优选的，所述抑制NEU3的表达为加入siRNA。0015优选的，所述siRNA为正义序列为5GGUUGACCUAGGUAUCUAU3，反义序列为5AUAGAUACCUAGGUCAACC3或正义序列为5CGCCUUUGCUUCAUCUACA3，反义序列为5UGUAGAUGAAGCAAAGGCG3或正义序列为5CACCAUGGUAGACUCAUUA3，反义序列为5UAAUGAGUCUACCAUGGUG3。0016优选的，所述siRNA为正义序

8、列为5GGUUGACCUAGGUAUCUAU3，反义序列为5说明书1/4 页3CN 117503936 A3AUAGAUACCUAGGUCAACC3。0017优选的，所述siRNA可通过抑制NEU3，下调唾液酸水平，降低内皮炎症损伤。而实现防治血管内皮炎症的作用。0018本申请中提供NEU3作为靶点在制备治疗内皮炎症损伤药物中的应用，NEU3基因沉默后，主要下调唾液酸水平，从而抑制内皮炎症损伤，本申请提供了内皮炎症损伤中的重要基因，从而方便开发新的治疗方法，从而从根本上进一步提高内皮炎症损伤的治疗效果，或者实现根除内皮炎症损伤的目的。附图说明0019图1为本发明一实施方式中验证NEU3在内皮炎

9、症损伤上调对比图。(A)使用不同浓度TNF诱导内皮炎症损伤中,NEU3 mRNA水平。(B)使用不同浓度TNF诱导内皮炎症损伤中,NEU3蛋白水平。(C)使用不同浓度TNF诱导内皮炎症损伤中，唾液酸水平。0020图2为本发明一实施方式中验证加入NEU3 siRNA后，NEU3表达水平降低对比图。(A)使用不同序列siRNA处理后，NEU3mRNA水平。(B)使用不同序列siRNA处理后，NEU3蛋白水平。0021图3为本发明一实施方式中验证加入NEU3 siRNA后，唾液酸水平降低对比图。0022图4为本发明一实施方式中验证加入NEU3 siRNA后，内皮炎症损伤水平降低对比图。具体实施方式0

10、023以下结合具体实施例，对本发明作进一步地详细说明。0024NEU3在制备防治血管内皮炎症损伤药物中的应用0025所述NEU3的全称为neuraminidase 3。基因编码的蛋白号：0026NP_001354789 1mrpadlpprp meespasssa pteteepgss aevmeevttc sfnsplfrqe ddrgityrip002761allyipptht flafaekrst rrdedalhlv lrrglrigql vqwgplkplm eatlpghrtm0028121npcpvweqks gcvflfficv rghvterqqi vsgrnaarlc fi

11、ysqdagcs wsevrdltee0029181vigselkhwa tfavgpghgi qlqsgrlvip aytyyipswf fcfqlpcktr phslmiysdd0030241lgvtwhhgrl irpmvtvece vaevtgragh pvlycsartp nrcraealst dhgegfqrla0031301lsrqlcepph gcqgsvvsfr pleiphrcqd ssskdaptiq qsspgsslrl eeeagtpses0032361wllyshptsr kqrvdlgiyl nqtpleaacw srpwilhcgp cgysdlaale eeg

12、lfgclfe0033421cgtkqeceqi afrlfthrei lshlqgdcts pgrnpsqfks n0034所述药物为抑制NEU3表达上调的siRNA。0035所述药物下调唾液酸水平，从而抑制内皮炎症损伤0036以下结合具体实施例对本申请进行阐述：0037准备实验：0038A内皮炎症损伤模型的建立0039在一实施方式中，所用细胞为HUVEC(人脐静脉内皮细胞)使用DMEM高血糖培养基(含10胎牛血清和1抗生素)在37和5CO2条件下培养。说明书2/4 页4CN 117503936 A40040将细胞种植于6孔板中，待细胞贴壁且生长至70密度时，加入TNF(肿瘤坏死因子)处理1

13、2小时后收集细胞。0041B细胞转染0042将细胞种植在12孔板中，待细胞长至6080培养面积进行转染；转染试剂为Lipofectamine 3000，操作前对细胞进行换液处理，换无血清的培养基；换液6h后，配置混合溶液(以下为12孔板一个孔用量)将4L Lipo3000用100L OptiMEM进行稀释，充分混匀，等待5min；将2L siRNA用100L OptiMEM进行稀释，将其与混合液充分混匀，等待20min；将上述混合溶液加入孔板内，继续培养分别在48h和72h收集细胞，0043实施例1：NEU3在内皮炎症损伤时上调0044步骤一：蛋白质提取和免疫印迹验证：0045将收集的细胞使用

14、含2蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解，收集裂解液于4以12000rpm离心10分钟后收集上清。加入5x装载缓冲液，混匀后100煮沸10分钟获得蛋白质样品。蛋白质于SDSPAGE分离后，电转到PVDF膜上。然后将PVDF膜用含5脱脂牛奶的TBST室温封闭1.5h，TBST清洗5min后与稀释后的一抗孵育过夜。TBST洗涤7分钟四次后，与特异性二抗室温孵育1h，TBST洗涤三次后使用增强发光剂以生物成像系统观察条带。ACTIN作为蛋白质内参被使用。0046步骤二：RNA提取和RTPCR验证0047(一)RNA的提取0048从6孔板培养的细胞中提取RNA，每孔加入1mL Trizol，在冰上静置

15、100049min，用细胞刮轻轻将细胞刮下，转移至无酶EP管中；0050用涡旋仪混匀后加入200L氯仿继续混匀，在冰上静置10min；0051提前预冷冷冻离心机，4，12000rpm，离心15min，轻轻取上清约3000052L，每次记录体积；0053取相同体积异丙醇，加入无酶EP管中，混匀静置10min；00544，12000rpm，离心15min，弃上清，加入75乙醇1mL(这里的75乙醇需要用无酶水和无水乙醇现配现用)；00554，7500rpm，离心5min，弃去上清(动作轻柔)，风干3min；0056加入DEPC水稀释(1020L)，测RNA浓度后，80保存。0057(二)RNA的逆

16、转0058将上述所提出的RNA通过逆转录试剂盒进行逆转录为cDNA，采用10L反应体系如下:00595xRTase Reaction Buffer Mix2L,Evo MMLV RTase Enzyme Mix 0.5L,Oligo dT(18T)Primer(50M)0.5L,Random 6mers Primer(100M)0.5L,Total RNARNase free water Up to10L。0060反应条件：3715min,855sec,4。0061(三)PCR反应0062在梯度PCR仪上进行逆转录，采用10L反应体系如下：00632XSYBR green qPCR Mix 5

17、L,Primer F 0.5L,Primer R 0.5L,DEPC Water 3L,cDNA 1L。说明书3/4 页5CN 117503936 A50064反应条件:951min 1次循环，9510s 601015s共40次循环。引物由北京擎科生物科技有限公司设计合成，内参选用为GAPDH，引物序列如下:0065GAPDH正义序 列：5 GCACCGTCAAGGCTGAGAAC3，反义序 列：5 TGGTGAAGACGCCAGTGGA3；NEU3正义序列：5AAGTGACAACATGCTCCTTCAA3，反义序列：5TCTCCTCGTAGAACGCTTCTC3。0066请参阅图1A和B,其

18、中图1A为使用不同浓度TNF诱导内皮炎症损伤中,NEU3 mRNA水平。图1B为使用不同浓度TNF诱导内皮炎症损伤中,NEU3蛋白水平。可以看出与对照组相比，NEU3在内皮炎症损伤时上调明显.0067步骤三：唾液酸浓度测定0068将收集的细胞培养基，使用乙腈(1：3)萃取后,取上清液在真空干燥机中挥干1.5h后醋酸铵复溶，使用LCMS测定唾液酸浓度。0069请参阅图1C,图1C为使用不同浓度TNF诱导内皮炎症损伤中唾液酸水平。可以看出与对照组相比，唾液酸含量在内皮炎症损伤时上调明显。0070实施例2：加入NEU3 siRNA后，NEU3表达水平降低0071步骤一:加入NEU3 siRNA后，N

19、EU3 mRNA水平降低0072本实施例中步骤一与实施例1中步骤二相似，其不同之处在于：本实施例中的细胞为转染NEU3 siRNA的内皮细胞。0073请参阅图2A，图2A为不同序列siRNA处理后，NEU3mRNA水平。可以看出与对照组相比，加入NEU3 siRNA后，NEU3 mRNA水平降低明显。0074步骤二：加入NEU3 siRNA后，NEU3蛋白水平降低0075本实施例中步骤二与实施例1中步骤一相似，其不同之处在于：本实施例中的细胞为转染NEU3 siRNA的内皮细胞。0076请参阅图2B，图2B为不同序列siRNA处理后，NEU3蛋白水平。可以看出与对照组相比，加入NEU3 siR

20、NA后，NEU3蛋白水平降低明显。0077实施例3：加入NEU3 siRNA后，唾液酸水平降低0078本实施例与实施例1中步骤三相似，其不同之处在于：本实施例中的细胞为转染NEU3siRNA后添加TNF(50ng/mL)处理的内皮细胞，所使用NEU3 siRNA正义序列为5GGUUGACCUAGGUAUCUAU3，反义序列为5AUAGAUACCUAGGUCAACC3。0079请参阅图3，图3为添加siRNA处理后，唾液酸水平。可以看出与对照组相比，加入NEU3siRNA后，唾液酸水平降低明显。0080实施例4：加入NEU3 siRNA后，内皮炎症损伤水平降低0081本实施例与实施例2中步骤二相似，其不同之处在于本实验例本实施例中的细胞为转染NEU3 siRNA后添加TNF(50ng/mL)处理的内皮细胞以及验证VCAM1,ICAM1的蛋白质。0082请参阅图4，图4为添加siRNA处理后，内皮炎症损伤水平。可以看出与对照组相比，加入NEU3 siRNA后，内皮炎症损伤水平降低明显。说明书4/4 页6CN 117503936 A6图1图2说明书附图1/2 页7CN 117503936 A7图3图4说明书附图2/2 页8CN 117503936 A8