利用玉米芽生长点直接分化多茎的方法及其应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910236362.3 (22)申请日 2019.03.27 (71)申请人 河北省农林科学院遗传生理研究所 （河北省农林科学院农产品质量安 全研究中心） 地址 050051 河北省石家庄市新华区和平 西路598号 (72)发明人 吕孟雨王海波董福双柴建芳 赵和周硕刘永伟杨帆 张俊敏 (74)专利代理机构 石家庄新世纪专利商标事务 所有限公司 13100 代理人 张晓龙 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) A01C 1/08(2006.01) (5

2、4)发明名称 一种利用玉米芽生长点直接分化多茎的方 法及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种利用玉米芽生长点直接分 化多茎的方法， 其包括如下步骤：（1） 种子消毒发 芽；（2） 去掉胚芽鞘和幼叶暴露出生长点；（3） 暗 培养；（4） 滴加植物激素混合液、 暗培养；（5） 光照 培养；（6） 炼苗移栽。 通过将本发明的方法利用到 玉米芽生长点转基因实验中， 使一个玉米芽生长 点不经过组织培养直接分化出多个植株， 这样获 得的每棵植株一般来源于不同的细胞， 从而可以 使每棵植株获得不同的转化事件， 转化一个玉米 芽生长点可以获得2-4棵不同的转基因植株， 受 玉米基因型的影响很小， 又可以获得较

3、高的转化 效率， 对于促进玉米转基因育种工作具有重要的 现实意义。 权利要求书1页 说明书3页 附图2页 CN 109892227 A 2019.06.18 CN 109892227 A 1.一种利用玉米芽生长点直接分化多茎的方法， 其特征在于， 其包括如下步骤： （1） 种子消毒发芽；（2） 去掉胚芽鞘和幼叶暴露出生长点；（3） 暗培养；（4） 滴加植物激素 混合液、 暗培养；（5） 光照培养；（6） 炼苗移栽。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 （1） 为： 先将玉米种子清理干净去 除杂质， 用无菌水冲洗3-5 min， 然后用0.1% HgCl2消毒8-12 min

4、， 用无菌水冲洗3-5次， 每 次2 min， 将种子放在加有1-3层滤纸经过高温灭菌的培养皿中， 每培养皿放15-25粒玉米种 子， 加6-10 ml无菌水， 23-25暗培养3-4 d进行发芽。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 （2） 为： 用刀将长度为0.3-0.5 cm 的玉米芽去掉胚芽鞘和幼叶， 暴露出生长点， 放置到经过高温灭菌的里面放置1-3层滤纸的 培养皿中， 每培养皿放8-15粒玉米种子加1-2.5 ml无菌水， 将培养皿加盖后密封。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 （3） 为： 将上述密封好的培养皿放 到23-25温度条件下进

5、行黑暗培养3-4 d。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 （4） 为： 向每个生长点滴加2-4 l 植物激素混合液， 所述植物激素混合液的成分和比例为1mg/ml的6-BA 2 ml+1 mg/ml的KT 0.5 ml， 然后向每个培养皿中加入无菌水7-9 ml， 加盖密封在23-25温度条件下暗培养3- 6 d。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 （5） 为： 打开培养皿盖， 向培养皿 中加无菌水到种子的1/3处， 放置到每天12 -14 h光照、 24-26温度条件下培养3-4d。 7.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 （6）

6、为： 当芽长度为0.5-2 cm时， 移栽到蛭石中培养3-5 d， 经过炼苗后移栽到花盆或田间， 按常规技术进行管理。 8.一种如权利要求17任一项所述的方法在获得多茎转基因植株中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109892227 A 2 一种利用玉米芽生长点直接分化多茎的方法及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种利用玉米芽生长点直接分化多茎的方法。 背景技术 0002 玉米作为重要的粮食和饲料作物， 通过玉米的遗传育种工作， 可以提高玉米的产 量或改善其品质等性状。 玉米转基因技术对于玉米性状的改良具有越来越重要的作用， 利 用玉米芽生长点作为转化受体已经为人们所重视， 并

7、得到越来越广泛的应用。 然而， 由于组 培体系具有品种特异性问题， 目前较成熟的玉米转基因的组织再生受体系统仅限于有限的 玉米品系； 如果将生长点经过离体组织培养后， 通过愈伤组织再分化成植株， 其受玉米基因 型的影响很大， 许多玉米基因型不能获得转基因植株， 极大地影响了玉米转基因技术的应 用范围。 为了克服玉米基因型对转化的影响， 有人已经不再对玉米芽生长点进行组织培养， 而是转化后直接长成植株， 这样做虽然可以克服玉米基因型对转化后再生的影响， 但也存 在着一个生长点只能获得一棵植株， 并且获得的植株往往是嵌合体， 其转化率较低。 如何提 高这种方法的转化效率， 已经被许多人所关注。 发

8、明内容 0003 本发明提供了一条便捷途径， 提供一种利用玉米芽生长点直接分化多茎的方法， 该方法可以用于不经过组织培养的玉米芽生长点转基因方法。 由于对玉米芽生长点转化 后， 其生长点的细胞一般不能达到100%被转化， 只有部分细胞被转化， 由这样的生长点分化 获得的转基因植株是由转化细胞和非转化细胞组成的嵌合体， 采用本发明的方法后可以从 不同部位长出多个植株， 由转化细胞部位长成的植株可以获得转基因植株， 由非转基因细 胞长成的植株为非转基因植株， 这样比一个生长点只长出一棵植株所获得转基因植株的机 会将会增加。 利用该发明与相应的玉米生长点转基因技术结合， 既可以在很大程度上克服 玉米

9、基因型限制， 又具有提高转化效率的作用。 0004 本发明采用如下技术方案： 一种利用玉米芽生长点直接分化多茎的方法， 其包括如下步骤：（1） 种子消毒发芽；（2） 去掉胚芽鞘和幼叶暴露出生长点；（3） 暗培养；（4） 滴加植物激素混合液、 暗培养；（5） 光照培 养；（6） 炼苗移栽。 0005 其中， 所述步骤 （1） 为： 先将玉米种子清理干净去除杂质， 用无菌水冲洗3-5 min， 然后用质量分数为0.1% HgCl2消毒8-12 min， 用无菌水冲洗3-5次， 每次1-2 min， 将种子放 在加有1-3层滤纸经过高温灭菌的培养皿 （规格： 直径9cm） 中， 每培养皿放15-25

10、粒玉米种 子， 加6-10 ml无菌水， 23-25暗培养3-4 d进行发芽。 0006 其中， 所述步骤 （2） 为： 用刀将长度为0.3-0.5 cm左右的玉米芽去掉胚芽鞘和幼 叶， 暴露出生长点， 放置到经过高温灭菌的里面放置1-3层滤纸的培养皿 （规格： 直径9cm） 中， 每培养皿放8-15粒玉米种子加1-2.5 ml无菌水， 将培养皿加盖后密封。 其中， 所述步骤 （3） 为： 将上述密封好的培养皿放到23-25温度条件下进行黑暗培养 说明书 1/3 页 3 CN 109892227 A 3 3-4 d。 0007 其中， 所述步骤 （4） 为： 向每个生长点滴加2-4 l植物激素

11、混合液， 所述植物激素 混合液的成分和比例为1mg/ml的6-BA 2 ml+1 mg/ml的KT 0.5 ml， 然后向每个培养皿中加 入无菌水7-9 ml， 加盖密封在23-25温度条件下暗培养3-6 d。 0008 其中， 所述步骤 （5） 为： 打开培养皿盖， 向培养皿中加无菌水到种子的1/3处， 放置 到每天12 -14 h光照、 24-26温度条件下培养3-4d。 0009 其中， 所述步骤 （6） 为： 当芽长度为0.5-2 cm左右时， 移栽到蛭石中培养3-5 d， 经 过炼苗后移栽到花盆或田间， 按常规技术进行管理。 0010 一种上述方法在获得多茎转基因植株中的应用。 00

12、11 本发明的有益效果在于： 由于用玉米芽生长点作为受体直接成苗获得的转基因植 株一般为嵌合体， 虽然可以克服玉米基因型的限制， 但是获得转基因后代的几率较低。 本发 明通过暴露出玉米芽生长点， 经过暗培养， 向生长点滴加适当浓度和比例的植物激素6-BA 和KT混合液， 再经过暗培养和光照培养的方法， 可以不经过离体组织培养直接诱导玉米种 子芽形成多个植株； 这样获得的每棵植株一般来源于不同的细胞， 为利用将玉米芽生长点 作为受体， 不经过组织培养直接成苗的农杆菌或基因枪转基因技术提供一种培育手段； 这 样转化一个玉米芽生长点， 可以获得多个植株， 从而提高玉米芽生长点的转化效率； 由于不 经

13、过组织培养， 成苗基本不受玉米基因型的限制， 为玉米转基因工作提供一种重要的辅助 手段。 附图说明 0012 图1为玉米芽生长点加激素后的芽情况。 0013 图2为玉米苗移栽后长出多个茎的植株情况。 0014 图3为在转基因实验中利用该方法获得多茎植株情况。 具体实施方式 0015 下述实施例利用玉米自交系 “郑58” 的种子作为试验材料。 实施例 0016 （1） 种子消毒发芽 将玉米种子清理干净， 用无菌水冲洗5 min， 然后用0.1% HgCl2消毒12 min， 用无菌水 冲洗5次， 每次2 min， 将种子放在加有2层滤纸并经过高温灭菌的培养皿 （规格： 直径9cm） 中， 每培养

14、皿放20粒玉米种子， 加8 ml无菌水， 23-25暗培养4 d。 0017 （2） 暴露出生长点 用手术刀将长度为0.3-0.5 cm左右的玉米芽， 去掉胚芽鞘和幼叶， 暴露出生长点， 放置 到经过高温灭菌加有2层滤纸的培养皿 （规格： 直径9cm） 中， 每培养皿放8-12粒玉米种子加1 ml无菌水， 将培养皿加盖后密封。 0018 （3） 暗培养 将密封的培养皿放到23-25温度条件下暗培养3 d。 0019 （4） 滴加植物激素混合液、 暗培养 说明书 2/3 页 4 CN 109892227 A 4 向每个生长点滴加2.5 l植物激素混合液， 植物激素混合液的成分和比例为1mg/ml

15、的 6-BA （6-苄氨基腺嘌呤） 2 l和1 mg/ml的KT （激动素） 0.5 l(此时的发芽情况如图1所示)， 向每个培养皿中加入无菌水8 ml， 加盖密封后在23-25温度条件下暗培养4 d。 0020 （4） 光照培养 打开培养皿盖， 向培养皿中加无菌水到种子的1/3处， 放置到每天12 h光照、 24-26温 度条件下培养3d。 0021 （5） 炼苗移栽 当芽长度为1-2 cm左右时， 移栽到蛭石中培养4 d， 经过炼苗后移栽到花盆， 在日光温 室培养。 0022 在经过上述方法的处理以后， 玉米在出芽的早期不出现多个茎的情况， 当移栽到 花盆以后， 随着玉米苗的生长， 约有4

16、0%的玉米苗在茎的基部有2-4个新芽生成， 每个芽可以 发育成1个完整的玉米植株 （如图2所示） ， 从而获得较多的玉米植株。 由于受到植物激素的 影响， 有些玉米的叶片有卷曲畸形现象， 这种情况在早期表现较重， 到后期较轻， 对玉米的 授粉结实基本没有影响。 0023 我们在利用玉米芽生长点作为转化受体用农杆菌进行转化后， 利用该发明的方法 获得了多茎转基因植株 （见图3） ， 提高了转化效率。 0024 以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述， 但并不限于此， 本 领域的技术人员很容易根据上述实施例领会本发明的精神， 并作出不同的引申和变化， 但 只要不脱离本发明的精神， 都在本发明的保护范围之内。 说明书 3/3 页 5 CN 109892227 A 5 图1 图2 说明书附图 1/2 页 6 CN 109892227 A 6 图3 说明书附图 2/2 页 7 CN 109892227 A 7