金刺梨天然多肽的制备方法和应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910051097.1 (22)申请日 2019.01.21 (71)申请人 北京中科唯新生物医学研究所有限 公司 地址 102206 北京市昌平区科技园区生命 园路8号院一区9号楼201 (72)发明人 菅晓勇 (51)Int.Cl. C07K 1/14(2006.01) C07K 1/16(2006.01) A23L 33/18(2016.01) (54)发明名称 一种金刺梨天然多肽的制备方法和应用 (57)摘要 本发明提供了一种金刺梨天然多肽的制备 方法,包括如下步骤

2、： 将金刺梨洗净后切成丁， 然 后在低温下匀浆并于低温下静置12小时， 离心后 的上清提取液经凝胶层析分离纯化， 收集分子量 在500-12000道尔顿的部分即为金刺梨天然多 肽， 该部分天然多肽收集液经真空冷冻干燥， 得 金刺梨天然多肽粉。 本发明提供的制备方法所得 金刺梨天然多肽分子量较低， 保留了较高的天然 活性， 可以用于制备保健食品及食品。 权利要求书1页 说明书3页 附图2页 CN 111454323 A 2020.07.28 CN 111454323 A 1.一种金刺梨天然多肽的制备方法,其特征在于其包括如下步骤： （1） 将新鲜金刺梨洗净， 切丁， 2-8冰浴下匀浆， 然后加入

3、预冷过的金刺梨重量1-3倍 的0.02-0.2摩尔/升 pH6.0-7.2的磷酸盐缓冲液浸泡， 置于2-8冰箱12小时后， 2-8冷冻 离心， 上清即为含有金刺梨天然多肽的粗提液； （2） 向步骤 （1） 所得含有金刺梨天然多肽的粗提液中加入洗脱液将其稀释至为含多肽 30-100毫克/毫升的溶液， 用葡聚糖凝胶层析分离， 收集分子量500-12000道尔顿的组分； （3） 将步骤 （2） 中的金刺梨天然多肽收集液真空冷冻干燥， 即得到金刺梨天然多肽提取 物冻干粉。 2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤 （1） 中所述磷酸盐缓冲液浓度为 0.05摩尔/升， 所述磷酸盐缓冲液pH为7

4、.0， 所述缓冲液用量为金刺梨的2倍。 3.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于： 步骤 （2） 中， 将步骤 （1） 收集的金刺梨 天然多肽粗提液用洗脱液稀释至为含多肽50毫克/毫升的溶液； 所述葡聚糖凝胶层析的分 离条件为： 凝胶层析柱为Sephadex G-25， 洗脱液为0.05摩尔/升的pH7.0磷酸盐缓冲液， 含 0.15摩尔/升的氯化钠溶液。 4.根据权利要求1-3任一所述的制备方法所得金刺梨天然多肽提取物均保留较高的天 然活性， 可以用于制备保健食品及食品中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111454323 A 2 一种金刺梨天然多肽的制备方法和应用 技术领域

5、 0001 本发明属于天然产物提取领域， 具体涉及一种金刺梨天然多肽及其制备方法及应 用。 背景技术 0002 金刺梨别名为光枝无子刺梨、 无籽刺梨、 金刺梨等。 金刺梨既是果， 又是药， 鲜食和 加工皆宜， 富含SOD （超氧化物歧化酶） 、 胡萝卜素、 维E、 维C以及20多种氨基酸和10余种对人 体有益的微量元素， 具有袪斑美容、 抗衰老、 助睡眠、 防癌抗癌、 排毒解毒、 排铅锰、 抗辐射、 抗疲劳、 增强免疫力、 健胃消食、 滋补强身等功效， 是一种防病养生的 “营养珍果” ， 被益为 “新山珍” 、“延年果” 。 因受季节性强、 保鲜难度大等因素限制， 现已将金刺梨通过高温干燥 后

6、加工成刺梨果汁、 刺梨果酒和刺梨糕等产品， 但是这些产品经过高温干燥加工的金刺梨 丧失了原有的色泽和营养价值。 0003 肽类分为寡肽和多肽， 是由两个或两个以上氨基酸缩合并以肽键相连的一类生物 活性物质。 肽类与生物体内其它物质相比， 其最大的特点是它们具有很高的生物活性和多 样性。 在生物体内， 很多生物活性物质大都是以多肽的分子结构及天然构象形式存在， 同时 也以天然生物活性的作用方式在机体发挥着重要的效应。 多肽在生物体的生长发育和新陈 代谢中起着至关重要的作用。 活性生物多肽可以调控细胞的生命活动以确保细胞正常分裂 和蛋白质正常合成， 因此对细胞分裂、 分化、 修复起重要作用。 因此

7、活性生物多肽与人类健 康、 抗衰老及延年益寿等密切相关且意义重大。 近年来的科学研究证实， 人体所吸收蛋白质 的主要形式不都是氨基酸， 而是活性生物肽， 因此可以通过补充活性生物多肽的方式调理 健康， 抵抗疾病和衰老。 0004 目前多肽的提取制备方法很多， 包括酸水解法、 碱水解法、 酶水解法以及几种方法 结合应用等方法。 然而， 保留天然活性的多肽的提取， 即在不改变这些化合物的结构和性质 的条件下， 尽量将提取物中的杂质分离出来， 需要较为温和的提取条件。 单纯的酸解或碱解 及酶解法提取多肽， 若所选择的溶液体系酸性或碱性太强， 都可能使被提取物发生不可逆 变性或过度水解以及分子构象等发

8、生明显改变， 使其逐步失去了多肽的生物学活性和功 能。 而且， 为了阻止酶解法在完成多肽提取后所加入的蛋白酶继续发生水解、 通常需要煮沸 进行灭酶活， 这样可能在一定程度上造成多肽生物活性的降低或破坏。 0005 重要的是上述方法都是通过分解蛋白来实现得到多肽， 总体上操作步骤繁琐， 引 入介质较多， 所得多肽的生物活性存在较多问题。 本方法提供了一种能够从生物组织中直 接提取天然多肽的简便的多肽制备方法， 该方法提取条件温和， 分离条件采取生理条件， 所 得多肽能够保留其天然活性。 发明内容 0006 本发明提供了一种从生物组织中直接提取天然多肽， 并且能够保留多肽天然活性 的简便的多肽制备

9、方法， 以至少解决现有技术中多肽提取方法复杂的技术及天然活性保留 说明书 1/3 页 3 CN 111454323 A 3 的问题。 0007 本发明提供了一种金刺梨天然多肽的制备方法,其特征在于其包括如下步骤： （1） 将新鲜金刺梨洗净， 切丁， 2-8冰浴下匀浆， 然后加入预冷过的金刺梨重量1-3倍 的0.02-0.2摩尔/升 （mol/L） pH6.0-7.2的磷酸盐缓冲液浸泡， 置于2-8冰箱12小时后， 2-8 冷冻离心， 上清即为含有金刺梨天然多肽粗提液； （2） 向步骤 （1） 所得含有金刺梨天然多肽的粗提液中加入洗脱液将其稀释至为含多肽 30-100毫克/毫升 （mg/mL）

10、的溶液， 用葡聚糖凝胶层析分离， 收集分子量500-12000道尔顿 （D） 的组分； （3） 将步骤 （2） 中的金刺梨天然多肽收集液冷冻干燥， 即得到金刺梨天然多肽提取物冻 干粉。 0008 优选的， 上述磷酸盐缓冲液浓度为0.05mol/L， 所述磷酸盐缓冲液pH为7.0， 所述缓 冲液用量为金刺梨的2倍。 0009 优选的， 上述步骤 （2） 中， 将步骤 （1） 收集的红薯叶天然多肽粗提液用洗脱液稀释 至为含多肽50mg/mL的溶液。 0010 优选的， 上述葡聚糖凝胶层析的分离条件为： 凝胶层析柱为Sephadex G-25， 内径 0.5-2厘米 （cm） ， 柱长30-120c

11、m， 洗脱液为0.05mol/L的pH7.0磷酸盐缓冲液， 含0.15mol/L的 氯化钠溶液， 流速0.4-7毫升/分钟 （mL/min） ， 进样量0.5-1mL， 检测波长280nm。 0011 根据上述制备方法所得金刺梨天然多肽提取物均保留较高的天然生物活性， 可以 用于制备保健食品及食品中的应用。 0012 本发明提供的金刺梨天然多肽制备方法操作简单， 能够从生物组织中直接提取天 然活性多肽， 该方法提取条件温和， 分离条件采取生理条件， 所得多肽能够保留其天然生物 活性。 本发明提供方法制备的金刺梨天然活性多肽比游离氨基酸的渗透压低， 更容易被吸 收， 食后不会引起腹泻等不良反应；

12、 同时金刺梨天然生物活性肽又具较低抗原性， 不会引起 过敏反应； 活性多肽在人体内能够参与体内蛋白质的合成， 促进相关细胞的有丝分裂与增 殖分化， 增强机体组织与细胞的新陈代谢， 因此具有在分子水平上调控细胞代谢， 修复异常 受损细胞的作用。 此外天然活性多肽还具有潜在的降血压、 降血脂、 抗氧化、 抗病毒、 抑菌、 降低胆固醇、 促进矿物质吸收、 改善物质代谢、 增强机体免疫能力等功能， 因此金刺梨天然 活性多肽能够在细胞水平上有效调控人体的健康， 预防退行性疾病和心脑血管疾病， 提高 免疫力， 延缓衰老等。 附图说明 0013 图1 金刺梨天然多肽凝胶层析图， 即实施例1的图。 0014

13、图2 金刺梨天然多肽对小鼠负重游泳时间的维持效果示意图。 0015 下面具体实施方式用于进一步说明但不限于本发明， 下面实施例仅为本发明一种 优选地实施方式。 具体实施方式 0016 实施例1 一种金刺梨天然活性多肽提取物的制备方法， 步骤如下： (1)取金刺梨， 切丁， 4冰浴下匀浆， 然后加入预冷过的金刺梨重量2倍的0.05mol/L 说明书 2/3 页 4 CN 111454323 A 4 pH7.0的磷酸盐缓冲液浸泡， 置于4冰箱12小时后， 4冷冻离心， 上清即为含有金刺梨天 然多肽粗提液； (2)向步骤(1)所得含有金刺梨多肽的粗提液中缓慢加入洗脱液稀释成含多肽50mg/ mL的溶

14、液， 用葡聚糖凝胶层析(Sephadex G-25， 内径1cm， 柱长30cm， 洗脱液为0.05mol/L， pH7.0的磷酸盐缓冲液， 含0.15mol/L氯化钠溶液， 流速2mL/min， 进样量1mL， 检测波长 280nm)分离， 收集分子量500-12000D的组分 （图1中介于8ml-17ml的峰即为要收集的目的多 肽） ； （3） 将步骤 （2） 中的金刺梨天然多肽收集液冷冻干燥， 即得到金刺梨活性多肽提取物冻 干粉。 0017 实施例2 一种金刺梨天然活性多肽提取物的制备方法， 步骤如下： (1)取金刺梨， 切丁， 4冰浴下匀浆， 然后加入预冷过的金刺梨重量3倍的0.2mo

15、l/L pH6.0的磷酸盐缓冲液浸泡， 置于2-8冰箱12小时后， 2-8冷冻离心， 上清即为含有金刺 梨天然多肽粗提液； (2)向步骤(1)所得含有金刺梨多肽的粗提液中缓慢加入洗脱液稀释成含多肽100mg/ mL的溶液， 用葡聚糖凝胶层析(Sephadex G-25， 内径1cm， 柱长30cm， 洗脱液为0.05mol/L， pH7.0的磷酸盐缓冲液， 含0.15mol/L氯化钠溶液， 流速1mL/min， 进样量1mL， 检测波长 280nm)分离， 收集分子量500-12000D的组分； （3） 将步骤 （2） 中的金刺梨天然多肽收集液冷冻干燥， 即得到金刺梨活性多肽提取物冻 干粉。

16、0018 实施例3 一种金刺梨天然活性多肽提取物的制备方法， 步骤如下： (1)取金刺梨， 切丁， 2-8冰浴下匀浆， 然后加入预冷过的金刺梨重量1倍的0.02mol/ L pH7.2的磷酸盐缓冲液浸泡， 置于2-8冰箱12小时后， 2-8冷冻离心， 上清即为含有金 刺梨天然多肽粗提液； (2)向步骤(1)所得含有金刺梨多肽的粗提液中缓慢加入洗脱液稀释成含多肽30mg/ mL的溶液， 用葡聚糖凝胶层析(Sephadex G-25， 内径1cm， 柱长30cm， 洗脱液为0.05mol/L， pH7.0的磷酸盐缓冲液， 含0.15mol/L氯化钠溶液， 流速0.8mL/min， 进样量1mL，

17、检测波长 280nm)分离， 收集分子量500-12000D的组分； （3） 将步骤 （2） 中的金刺梨天然多肽收集液冷冻干燥， 即得到金刺梨活性多肽提取物冻 干粉。 0019 用上述实施例1制备得到的金刺梨天然活性多肽提取物进行提高机体运动能力验 证： 将小鼠分为对照组( 灌生理盐水)、 实验1组( 每天灌服金刺梨天然活性多肽5mg/kg)、 实验2组( 每天灌服金刺梨天然活性多肽10mg/kg) 和实验3组( 每天灌服金刺梨天然活性 多肽15mg/kg)。 各组动物10只， 饲养30天。 各组动物分别在其尾部绑上铅丝( 按体重的5 计算)， 进行负重游泳试验， 观察各组动物进行游泳而不溺毙的时间， 其结果如图2所示， 实 验组与对照组存在显著差异 （P0.001） 。 由图2可知， 与对照组相比， 服用金刺梨天然活性多 肽小鼠进行负重游泳的时间延长， 且剂量越大， 负重游泳维持的时间越长， 证明金刺梨天然 活性多肽能有效提高机体抗疲劳能力。 说明书 3/3 页 5 CN 111454323 A 5 图1 说明书附图 1/2 页 6 CN 111454323 A 6 图2 说明书附图 2/2 页 7 CN 111454323 A 7