辣木四倍体诱导和扩繁方法.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911128416.0 (22)申请日 2019.11.18 (71)申请人 华南农业大学 地址 510640 广东省广州市天河区五山路 华南农业大学林学与风景园林学院 (72)发明人 杨恩点张俊杰林孟飞陈晓阳 (74)专利代理机构 广州科粤专利商标代理有限 公司 44001 代理人 朱双刘明星 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) A01H 1/08(2006.01) (54)发明名称 一种辣木四倍体诱导和扩繁方法 (57)摘要 本发明公开了一种辣

2、木四倍体诱导和扩繁 方法。 本发明以辣木叶片作为外植体材料， 用秋 水仙素处理辣木外植体， 优化影响秋水仙素对辣 木外植体再生及多倍体诱导的条件， 四倍体获得 率达25 ， 再生效率达86 .67 ， 生根率达 93.3， 具有显著的优势； 以期改良辣木品质， 培 育优质辣木四倍体品种， 满足辣木种质资源需 求， 通过多倍体育种手段为辣木品质改良提供技 术方法和理论依据。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 111296286 A 2020.06.19 CN 111296286 A 1.一种辣木四倍体诱导和扩繁方法， 其特征在于， 包括以下步骤： a.叶片外植体预培养： 切取无菌辣木苗

3、幼叶作为外植体， 在小叶近轴面划出细小伤口后， 将远轴面朝下放置 接种在诱导培养基上预培养3d， 所述的诱导培养基： 每升含有6-BA 0.8mg、 KT 0.2mg、 NAA 0.05mg、 蔗糖30g和琼脂4.5g， 余量为MS培养基， pH5.8-6.0； b.秋水仙素诱导培养： 将经预培养后的外植体转接到秋水仙素诱导培养基上暗培养21d， 培养温度为26； 所 述的秋水仙素诱导培养基： 每升含有秋水仙素100mg、 6-BA 0.8mg、 KT 0.2mg、 NAA 0.05mg、 蔗糖30g和琼脂4.5g， 余量为MS培养基， pH5.8-6.0； c.辣木根尖染色体计数： 切下秋水

4、仙素诱导培养的不定芽接种至MS固体培养基中培养， 待再生根长至2cm左右 时， 取根尖进行染色体计数， 鉴定辣木四倍体； d.辣木四倍体扩繁培养： 将获得的辣木四倍体茎节切至长度为1-2cm作为外植体， 横放接种在辣木四倍体不定 芽诱导培养基， 诱导再生； 所述的辣木四倍体不定芽诱导培养基为： 每升含有6-BA 1.2mg、 NAA 0.05mg、 蔗糖30g和琼脂4.5g， 余量为MS培养基， pH5.8-6.0； e.辣木四倍体生根培养： 将辣木四倍体再生获得的不定芽切割下来， 将不定芽插入培养基至0.5cm左右深， 接种 到辣木四倍体不定根诱导培养基培养， 诱导生根形成辣木四倍体植株；

5、所述的辣木四倍体 不定根诱导培养基为： 每升含有NAA 0.1mg、 蔗糖30g和琼脂4.5g， 余量为MS培养基， pH5.8- 6.0。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的步骤a、 c、 d、 e中的培养条件： 温度为 26， 光照强度为2000lx， 光照时间为12h/d。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的步骤c的MS固体培养基， 每升含有蔗 糖30g和琼脂4.5g， 余量为MS培养基， pH5.8-6.0。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111296286 A 2 一种辣木四倍体诱导和扩繁方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体

6、涉及一种辣木四倍体诱导和扩繁方法。 背景技术 0002 辣木(Moringa oleifera Lam.)作为一种多功能树种， 其果荚、 叶片和根中都含有 多种矿物质和维生素， 作为一种有营养价值的蔬菜的同时辣木还有一定的保健功能。 辣木 营养丰富， 符合优质饲料的标准， 叶片中粗蛋白含量高， 维生素含量丰富， 被用作饲料或饲 料的辅料， 不仅能促进动物的生长， 提高动物免疫力和肉质量， 还可以节省饲料成本。 辣木 本身产量高， 栽培简单， 适应性广， 抗逆性强， 可作为木本饲料弥补蛋白质饲料严重短缺的 问题， 也是一种很好的混农林树种。 近些年， 随着研究和辣木资源开发的进展， 辣木也受到

7、越来越多的重视。 0003 植株染色体经诱导加倍后， 由于基因的互作效应和基因的剂量效应， 植株细胞生 理平衡被打破， 多倍体会表现出 “巨大性” ， 多倍体植物适应性及抵抗胁迫能力都有所增强， 根、 茎、 叶等营养器官的生物量也显著增加。 因此， 如能诱导获得辣木多倍体， 则可以改良辣 木品质， 培育优质辣木多倍体品种， 满足辣木种质资源需求。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种辣木四倍体诱导和扩繁方法。 0005 本发明的辣木四倍体诱导和扩繁方法， 包括以下步骤： 0006 a.叶片外植体预培养： 0007 切取无菌辣木苗幼叶作为外植体， 在小叶近轴面划出细小伤口后， 将远轴面朝下

8、 放置接种在诱导培养基上预培养3d， 所述的诱导培养基： 每升含有6-BA 0.8mg、 KT 0.2mg、 NAA 0.05mg、 蔗糖30g和琼脂4.5g， 余量为MS培养基， pH5.8-6.0； 0008 b.秋水仙素诱导培养： 0009 将经预培养后的外植体转接到秋水仙素诱导培养基上暗培养21d， 培养温度为26 ； 所述的秋水仙素诱导培养基： 每升含有秋水仙素100mg、 6-BA 0.8mg、 KT 0.2mg、 NAA 0.05mg、 蔗糖30g和琼脂4.5g， 余量为MS培养基， pH5.8-6.0； 0010 c.辣木根尖染色体计数： 0011 切下秋水仙素诱导培养的不定芽

9、接种至MS固体培养基中培养， 待再生根长至2cm 左右时， 取根尖进行染色体计数， 鉴定辣木四倍体； 0012 d.辣木四倍体扩繁培养： 0013 将获得的辣木四倍体茎节切至长度为1-2cm作为外植体， 横放接种在辣木四倍体 不定芽诱导培养基， 诱导再生； 所述的辣木四倍体不定芽诱导培养基为： 每升含有6-BA 1.2mg、 NAA 0.05mg、 蔗糖30g和琼脂4.5g， 余量为MS培养基， pH5.8-6.0； 0014 e.辣木四倍体生根培养： 0015 将辣木四倍体再生获得的不定芽切割下来， 将不定芽插入培养基至0.5cm左右深， 说明书 1/5 页 3 CN 111296286 A

10、 3 接种到辣木四倍体不定根诱导培养基培养， 诱导生根形成辣木四倍体植株； 所述的辣木四 倍体不定根诱导培养基为： 每升含有NAA 0.1mg、 蔗糖30g和琼脂4.5g， 余量为MS培养基， pH5.8-6.0。 0016 优选， 所述的步骤a、 c、 d、 e中的培养条件： 温度为26， 光照强度为2000lx， 光照时 间为12h/d。 0017 优选， 所述的步骤c的MS固体培养基， 每升含有蔗糖30g和琼脂4.5g， 余量为MS培养 基， pH5.8-6.0。 0018 本发明的辣木(Moringa oleifera Lam.)四倍体诱导和扩繁的方法， 以辣木叶片 作为外植体材料，

11、用秋水仙素处理辣木外植体， 优化影响秋水仙素对辣木外植体再生及多 倍体诱导的各种条件， 本发明方法四倍体获得率达25， 再生效率达86.67， 生根率达 93.3， 具有显著的优势。 本发明使用秋水仙素诱导辣木外植体叶片得到辣木四倍体， 以期 改良辣木品质， 培育优质辣木四倍体品种， 满足辣木种质资源需求， 通过多倍体育种手段为 辣木品质改良提供技术方法和理论依据。 附图说明 0019 图1是二倍体(2n28)辣木根尖染色体； 0020 图2是四倍体(4n56)辣木根尖染色体。 具体实施方式 0021 以下实施例是对本发明的进一步说明， 而不是对本发明的限制。 0022 实施例1 0023 下

12、面结合辣木(Moringa oleifera Lam.)M-2无性系的四倍体诱导和扩繁具体对 本发明方法进行说明。 0024 主要试剂的配制： 0025 卡宝品红染液： 先配制原液A(取3g碱性品红溶于体积分数70乙醇水溶液中， 定 容至100mL)， 原液B(取原液A 10mL加入到5石炭酸水溶液中， 定容至90mL)， 原液C(取原液 B 55mL， 加入6mL冰醋酸和6mL福尔马林)， 其中原液A和原液C可长期保存， 原液B一般两周内 用完。 取原液C10-20mL加入80-90mL体积分数45醋酸水溶液， 再加入山梨醇1.8g， 配成10- 20浓度的卡宝品红溶液。 该溶液最好放置两周

13、后再使用， 立即使用染色效果差。 0026 一、 辣木四倍体诱导和扩繁 0027 1.叶片外植体预培养： 0028 选择无菌辣木苗幼叶(即处于第二发育阶段的叶片， 单个小叶约0.5cm3左右大小) 作为外植体， 在超净工作台上， 用无菌手术刀片在小叶近轴面划出细小伤口后， 将远轴面朝 下放置在诱导培养基上培养， 培养条件： 温度为26， 光照强度为2000lx， 光照时间为12h/ d， 分别预培养不同天数(0d， 3d， 6d， 9d)， 分析不同预培养时长对辣木叶片外植体再生及对 再生苗染色体加倍的影响， 结果分别如表1、 表2中所示。 所用的诱导培养基： 每升含有6- BA0.8mg、

14、KT 0.2mg、 NAA 0.05mg、 蔗糖30g和琼脂4.5g， 余量为MS培养基， pH调至5.8-6.0； 是 将上述组分混匀， 在121， 1.1Mpa条件下灭菌15min制备得到。 0029 表1预培养时间对辣木叶片外植体再生的影响 说明书 2/5 页 4 CN 111296286 A 4 0030 0031 *表中每一列数值之后相同的字母表示在邓肯多重实验中差异不显著(P0.05) 0032 表2预培养时间对辣木叶片外植体再生苗染色体加倍的影响 0033 0034 *表中每一列数值之后相同的字母表示在邓肯多重实验中差异不显著(P0.05) 0035 2.秋水仙素诱导培养： 00

15、36 将经预培养后的辣木叶片外植体， 转接到秋水仙素诱导培养基(其中含有终浓度 为100mg/L的秋水仙素)上， 26暗培养处理不同时间(0d， 7d， 14d， 21d， 28d)， 处理结束后， 将外植体转接到诱导培养基上继续培养， 分析不同秋水仙素处理时长对辣木叶片外植体再 生及对再生苗染色体加倍的影响， 结果分别如表3、 表4中所示。 因为秋水仙素高温高压灭菌 易分解， 故采用过滤方式灭菌。 先将诱导培养基溶液(每升含有6-BA 0.8mg、 KT 0.2mg、 NAA 0.05mg、 蔗糖30g和琼脂4.5g， 余量为MS培养基， pH5.8-6.0)在121， 1.1Mpa条件下灭

16、菌 15min， 待温度降至50-60时， 加入用0.45 m细菌过滤器过滤除菌的秋水仙素水溶液母液， 使得培养基中秋水仙素的终浓度为100mg/L， 得到秋水仙素诱导培养基。 0037 表3 100mg/L秋水仙素处理对辣木叶片外植体再生的影响 0038 0039 *表中每一列数值之后相同的字母表示在邓肯多重实验中差异不显著(P0.05) 0040 表4 100mg/L秋水仙素处理不同时间对辣木叶片外植体再生苗染色体加倍的影响 说明书 3/5 页 5 CN 111296286 A 5 0041 0042 *表中每一列数值之后相同的字母表示在邓肯多重实验中差异不显著(P0.05) 0043 辣

17、木根尖染色体计数： 待秋水仙素诱导培养后的叶片产生的不定芽长至2cm左右， 切下不定芽接种至MS固体培养基中(每升含有蔗糖30g和琼脂4.5g， 余量为MS培养基， pH5.8-6.0； 是将上述组分混匀， 在121， 1.1Mpa条件下灭菌15min制备得到)培养， 培养条 件： 温度为26， 光照强度为2000lx， 光照时间为12h/d。 待组培瓶中再生植株根长至2cm左 右时， 上午11点前后， 取根并放入装有纯净水的离心管(纯净水要淹没材料)， 然后迅速将装 有材料的离心管置于冰上预处理6h。 预处理结束后， 将根尖放入卡诺氏固定液(V95 乙 醇： V冰 乙 酸 3： 1)中， 室

18、温下固定5-24h。 固定结束后， 将根尖取出放入1mol/L的HCl溶液中， 60水浴 10-15min进行酸解。 将酸解后的根尖在流水下冲洗20min， 将盐酸冲洗干净， 否则影响后面 的染色体着色。 冲洗干净的根尖放在纯水中低渗5min。 然后将根尖放在干净的载玻片上， 用 刀片切取根尖白色部分0.5-1mm， 滴上卡宝品红染色20min。 然后盖上盖玻片， 轻轻敲打让细 胞分散。 最后在显微镜下观察计数。 0044 辣木四倍体扩繁培养： 在超净工作台里， 用锋利的手术刀片将获得的辣木四倍体 茎节切至长度为1-2cm作为外植体， 横放接种在含有不同6-BA浓度(0， 0.4， 0.8，

19、1.2， 1.6mg/ L)和0.05mg/L NAA的辣木四倍体不定芽诱导培养基(每升含有对应浓度的6-BA 1、 NAA 0.05mg、 蔗糖30g和琼脂4.5g， 余量为MS培养基， pH5.8-6.0； 是将上述组分混匀， 在121， 1.1Mpa条件下灭菌15min制备得到)中， 培养诱导再生。 分析不同6-BA浓度对辣木四倍体再 生的影响， 结果如表5所示。 培养条件： 温度为26， 光照强度为2000lx、 光照时间为12h/d， 培养30天。 0045 表5 6-BA浓度对辣木四倍体再生的影响 0046 0047 *表中每一列数值之后相同的字母表示在邓肯多重实验中差异不显著(P

20、0.05) 0048 辣木四倍体生根培养： 在超净工作台里， 用锋利的手术刀片将辣木四倍体再生获 得的不定芽从母体组织上切割下来， 将不定芽插入培养基至0.5cm左右深， 接种到含有不同 说明书 4/5 页 6 CN 111296286 A 6 浓度NAA(0， 0.05， 0.1， 0.15mg/L)的培养基(每升含有对应浓度的NAA、 蔗糖30g和琼脂4.5g， 余量为MS培养基， pH5.8-6.0； 是将上述组分混匀， 在121， 1.1Mpa条件下灭菌15min制备得 到)中让不定芽生根， 诱导生根形成辣木四倍体植株。 NAA浓度对辣木四倍体生根的影响结 果如表6所示。 培养条件：

21、温度为26， 光照强度为2000lx， 光照时间为12h/d。 0049 表6 NAA浓度对辣木四倍体生根的影响 0050 0051 *表中每一列数值之后相同的字母表示在邓肯多重实验中差异不显著(P0.05) 0052 二、 结果分析 0053 秋水仙素诱导前对外植体进行预培养能有效提高其再生效率， 综合考虑外植体再 生效率及四倍体诱导率， 以预培养3d效果最好， 在该条件下， 外植体再生效率为33.33， 四 倍体诱导率为20。 此外， 秋水仙素处理时间对外植体再生效率和辣木四倍体诱导率影响 极大， 以100mg/L秋水仙素处理21d最佳， 四倍体获得率达25。 0054 以获得的辣木四倍体茎节作为外植体材料， 最优辣木四倍体不定芽诱导培养基 为： 每升含有6-BA 1.2mg、 NAA 0.05mg、 蔗糖30g和琼脂4.5g， 余量为MS培养基， pH5.8-6.0； 再生效率达86.67， 平均每个外植体可收获不定芽2.87个； 最优辣木四倍体不定根诱导培 养基为： 每升含有NAA 0.1mg、 蔗糖30g和琼脂4.5g， 余量为MS培养基， pH5.8-6.0， 生根率达 93.3。 说明书 5/5 页 7 CN 111296286 A 7 图1 图2 说明书附图 1/1 页 8 CN 111296286 A 8