骨肽及其成骨生理活性确证方法与用途.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910784028.1 (22)申请日 2019.08.23 (71)申请人 中国农业科学院农产品加工研究所 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路2号 院 (72)发明人 张春晖叶孟亮贾伟秦晓洁 沈青山张鸿儒 (74)专利代理机构 北京远大卓悦知识产权代理 事务所(普通合伙) 11369 代理人 史霞 (51)Int.Cl. C07K 7/08(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) G01N 33/68(2006.01) (54)发明名称 骨肽及

2、其成骨生理活性确证方法与用途 (57)摘要 本发明公开了一种骨肽的成骨生理活性确 证方法， 包括： 预测骨肽潜在致敏性， 分析骨肽的 抗原免疫性； 建立并模拟机体胃部微环境模型， 分析骨肽在胃部消化特性； 建立并模拟机体肠部 微环境模型， 分析骨肽在肠部消化特性； 建立并 模拟机体Caco-2小肠上皮细胞单层膜吸收模型， 考查骨肽在小肠上皮细胞的可运载特性； 分析其 对Wnt/-catenin通路的影响。 若骨肽无抗原免 疫性， 对胃肠部消化具有一定耐受性， 可经过在 小肠上皮细胞运载至作用靶点， 可激活机体内 Wnt/-catenin信号通路， 则能用于功能食品 中。 本发明具有较好的预测和

3、评价多肽的成骨生 理活性的能力， 可为指导今后利用畜禽骨胶原蛋 白肽开发生物活性功能食品提供理论依据。 权利要求书2页 说明书13页 序列表4页 附图7页 CN 110950930 A 2020.04.03 CN 110950930 A 1.一种骨肽， 其特征在于， 所述骨肽具有成骨活性， 所述骨肽的氨基酸序列如SEQ ID NO： 1所示。 2.一种骨肽的成骨生理活性确证方法， 其特征在于， 包括依次进行的如下步骤： 步骤一、 利用生物信息学方法预测骨肽的潜在致敏性， 分析骨肽的抗原免疫性； 步骤二、 建立并模拟机体胃部微环境模型， 分析骨肽在胃部消化特性； 步骤三、 建立并模拟机体肠部微环

4、境模型， 分析骨肽在肠部消化特性； 步骤四、 建立并模拟机体Caco-2小肠上皮细胞单层膜吸收模型， 分析骨肽在小肠上皮 细胞的可运载特性； 步骤五、 分析所述骨肽对Wnt/ -catenin通路的影响； 若所述骨肽无抗原免疫性， 且对胃肠部消化具有一定耐受性， 可经过在小肠上皮细胞 运载至作用靶点， 且可激活机体内Wnt/ -catenin信号通路， 则该骨肽能用于功能食品中。 3.如权利要求2所述的骨肽的成骨生理活性确证方法， 其特征在于， 所述步骤二中， 建 立并模拟机体胃部微环境模型的具体步骤包括： 首先配置骨肽溶液， 之后将骨肽溶液置于 37恒温水环境中， 然后调节骨肽溶液pH至2.

5、0， 再向其中加入胃蛋白酶， 启动模拟体外胃 部消化， 同时磁力搅拌器搅拌， 模拟胃部蠕动一段时间， 最后取出部分消化液A作为样本， 分 析该骨肽在胃部的消化特性。 4.如权利要求3所述的骨肽的成骨生理活性确证方法， 其特征在于， 所述步骤三中， 建 立并模拟机体肠部微环境模型的具体步骤包括： 首先将步骤二中剩余的溶液的pH调节至 7.5， 之后按照酶与底物质量比1:50向其中加入胰液素， 启动模拟体外肠道消化， 同时磁力 搅拌器搅拌， 模拟肠部蠕动一段时间， 最后取出部分消化液B作为样本， 分析该骨肽在肠部 的消化特性。 5.如权利要求2所述的骨肽的成骨生理活性确证方法， 其特征在于， 所述

6、步骤四中， 建 立并模拟机体Caco-2小肠上皮细胞单层膜吸收模型的具体步骤包括： 首先将Caco-2细胞细胞悬浮液， 接种至培养小室， 向培养小室顶侧AP加入细胞悬液， 向 培养小室底侧加入完全培养基， 培养一段时间后， 测定跨膜电阻值， 以跨膜电阻值为参考指 标， 连续培养细胞1215天直至跨膜电阻值达到最大值时， 表明Caco-2小肠上皮细胞单层 膜吸收模型构建成功； Caco-2细胞单层膜模型构建成功后， 进行骨肽的吸收转运试验： 用HBSS缓冲液清洗细 胞单层膜2次， 分别向AP、 BP两侧加入0.5mL、 1.5mL含0.05DMSO的HBSS缓冲液， 然后于体积 比5CO2、 9

7、5空气和温度37恒温培养30min， 然后除去缓冲液， 向AP侧加入0.5mL 10mM 骨肽， BL侧加入1.5mL含0.05DMSO的HBSS缓冲液， 继续于体积比5CO2、 95空气和温度 37恒温培养； 其余组， 在加入骨肽之前， 首先向AP、 BP侧分别加入0.5mL、 1.5mL与细胞吸收转运相关 通路促进剂和抑制剂： 浓度为0.5 g/mL的细胞松弛素D、 500nM的渥曼青霉素、 25mM的Gly- Sar， 以分析其吸收转运机制， 同样培养30min后， 除去缓冲液， 再分别向AP侧加入0.5mL 10mM骨肽溶液， 向BP侧加入1.5mL含0.05DMSO的HBSS缓冲液，

8、 2h后从BL侧取样100 L， 放 置-20保存用于检测。 6.如权利要求2所述的骨肽的成骨生理活性确证方法， 其特征在于， 还包括对骨肽进行 序列分析以获得其序列的步骤； 权利要求书 1/2 页 2 CN 110950930 A 2 所述步骤一中， 利用AlgPred在线数据库预测骨肽的潜在致敏性； 步骤二中， 胃蛋白酶与骨肽的质量比为1:50， 胰液素与骨肽的质量比也为1:50。 7.如权利要求2所述的骨肽的成骨生理活性确证方法， 其特征在于， 所述胃部微环境模 型于胃部模拟容器中进行， 所述胃部模拟容器包括外周壁和与所述外周壁封闭连接的底 部， 所述外周壁由柔性材料制成， 在所述外周壁

9、上相对的两侧设置有一对挤压部， 所述挤压 部配置成通过同时对其进行压缩操作， 而使所述外周壁在其径向上扁平化， 于所述外周壁 内沿其径向设置有复位弹簧， 所述复位弹簧的两端对应于所述一对挤压部的位置处固定于 所述外周壁的内侧， 其中， 所述外周壁在俯视观察下的形状呈椭圆形， 所述一对挤压部和复 位弹簧沿椭圆的长轴设置， 且所述一对挤压部和复位弹簧位于所述胃部模拟容器的下侧， 在竖直方向上距离所述底部的高度不超过所述胃部模拟容器总高度的1/3。 8.如权利要求2所述的骨肽的成骨生理活性确证方法， 其特征在于， 步骤五中， 基于 Real-time qPCR和Western blot方法分析所述骨

10、肽对Wnt/ -catenin通路存在的影响， 其 中， Real-time qPCR中检测基因的引物包含如SEQ ID NO： 2和SEQ ID NO： 3所示的引物对， 如SEQ ID NO： 4和SEQ ID NO： 5所示的引物对， SEQ ID NO： 6和SEQ ID NO： 6所示的引物对， SEQ ID NO： 8和SEQ ID NO： 9所示的引物对， SEQ ID NO： 10和SEQ ID NO： 11所示的引物对， 如SEQ ID NO： 12和SEQ ID NO： 13所示的引物对， SEQ ID NO： 14和SEQ ID NO： 15所示的引物 对， SEQ ID

11、 NO： 16和SEQ ID NO： 17所示的引物对， SEQ ID NO： 18和SEQ ID NO： 19所示的引 物对。 9.如权利要求2所述的骨肽的成骨生理活性确证方法， 其特征在于， 所述一定耐受性是 骨肽在胃部消化后仍存在完整的肽段， 且完整肽段所占比例应在20及以上。 10.如权利要求1所述的骨肽在科学研究或成骨研究活性功能食品制作中的用途。 权利要求书 2/2 页 3 CN 110950930 A 3 骨肽及其成骨生理活性确证方法与用途 技术领域 0001 本发明属于分子生物学领域， 涉及一种骨肽， 特别涉及一种骨肽的成骨生理活性 确证方法， 更涉及骨肽的用途。 背景技术 0

12、002 随着我国进入老龄化社会， 居民骨质疏松症的发病率也呈逐年上升的态势， 骨质 疏松症所诱发的机体骨折不仅增加了老年人病残率和病死率， 也加重了社会经济负担， 已 成为一个严重的公众健康问题。 骨质疏松症是一种以骨质量减少、 骨显微结构发生退化、 骨 脆性增加为特征的全身性机体骨代谢性疾病。 临床上， 治疗骨质疏松症药物包括利塞膦酸 盐、 对苯二甲酸、 阿仑膦酸、 二磷酸盐、 唑来膦酸、 特立帕肽等， 但服用这些药物往往存在诸 如食道发炎、 恶心、 腹痛甚至有罹患生殖系统癌变的副作用， 其潜在的毒性和副作用在一定 程度上限制了大范围应用。 因此， 寻找能够促进骨形成和逆转骨结构损伤的更安全

13、、 食物源 的天然替代品正受到越来越多的关注。 0003 畜禽骨中含有丰富的胶原蛋白(主要为I型， 含量约占动物鲜骨重的20)， 胶原蛋 白是一种独特的结构蛋白， 研究表明补充胶原蛋白肽可以增加骨胶原纤维网架的规则性和 牢固性， 促进钙盐有序沉积， 增加骨强度和骨密度， 是一种潜在的抗骨质疏松活性肽的理想 来源。 然而， 畜禽来源蛋白质和多肽类食品对人体可能有潜在的毒性和致敏性， 这会对人体 健康带来不利影响， 很大程度上影响消费者认可和食用。 已有研究表明， 蛋白经水解后产生 的多肽通常不具有毒性， 且相较亲本蛋白质更不具有致敏性。 然而， 也有部分报道小分子肽 仍保留天然蛋白的部分致敏原性

14、， 具有潜在致敏性。 因此， 在考虑应用生物活性多肽作为功 能食品添加剂的同时， 明确其潜在毒性及致敏性显得尤为重要。 0004 蛋白质和多肽类食品在食用过程中往往会被广泛降解， 随着进入小肠， 又会被小 肠上皮细胞上各种蛋白酶进一步水解， 最终水解为较小的肽段并释放至细胞间质被吸收。 已有研究报道， 较大分子量肽段也可伴随血液循环并最终被吸收， 但这部分剂量相对较低， 其消化吸收机制仍不明晰。 通常情况吓， 生物活性物质在经胃肠消化后， 其结构和功能会发 生一定改变， 甚至失去生物活性， 因此， 大多数生物活性物质进入体内后往往无法发挥其原 有(体外)生物活性功能。 如何系统评价和确认骨肽的

15、成骨生理活性， 以促进其开发和利用， 是目前本领域的研究热点之一。 发明内容 0005 本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷， 并提供至少后面将说明的优 点。 0006 本发明再有一个目的是提供一种骨肽。 0007 本发明还有一个目的是提供一种骨肽的成骨生理活性确证方法， 克服现有评价骨 肽在机体成骨生理活性确证方法研究相对匮乏的缺点。 本发明基于生物信息学、 胃肠道消 化模型、 Caco-2小肠上皮细胞吸收模型等系统研究骨肽的消化吸收特性评价及调控细胞通 说明书 1/13 页 4 CN 110950930 A 4 路的确证方法， 从而较好的预测和评价多肽的成骨生理活性的能力， 为指导

16、今后利用畜禽 骨胶原蛋白肽开发生物活性功能食品提供理论依据。 0008 本发明还有一个目的是提供骨肽的用途。 0009 为此， 本发明提供的技术方案为： 0010 一种骨肽， 所述骨肽具有成骨活性， 所述骨肽的氨基酸序列如SEQ ID NO： 1所示。 0011 一种骨肽的成骨生理活性确证方法， 包括依次进行的如下步骤： 0012 步骤一、 利用生物信息学方法预测骨肽的潜在致敏性， 分析骨肽的抗原免疫性； 0013 步骤二、 建立并模拟机体胃部微环境模型， 分析骨肽在胃部消化特性； 0014 步骤三、 建立并模拟机体肠部微环境模型， 分析骨肽在肠部消化特性； 0015 步骤四、 建立并模拟机体

17、Caco-2小肠上皮细胞单层膜吸收模型， 分析骨肽在小肠 上皮细胞的可运载特性； 0016 步骤五、 分析所述骨肽对Wnt/ -catenin通路的影响； 0017 若所述骨肽能够满足无抗原免疫性， 且对胃肠部消化具有一定耐受性， 可经过在 小肠上皮细胞运载至作用靶点(可运载性)， 且可激活机体内Wnt/ -catenin信号通路， 则该 骨肽能用于功能食品中。 0018 优选的是， 所述的骨肽的成骨生理活性确证方法中， 所述步骤二中， 建立并模拟机 体胃部微环境模型的具体步骤包括： 首先配置骨肽溶液， 之后将骨肽溶液置于37恒温水 环境中， 然后调节骨肽溶液pH至2.0， 再向其中加入胃蛋白

18、酶， 启动模拟体外胃部消化， 同时 磁力搅拌器搅拌， 模拟胃部蠕动一段时间， 最后取出部分消化液A作为样本， 分析该骨肽在 胃部的消化特性。 0019 优选的是， 所述的骨肽的成骨生理活性确证方法中， 所述步骤三中， 建立并模拟机 体肠部微环境模型的具体步骤包括： 首先将步骤二中剩余的溶液的pH调节至7.5， 之后按照 酶与底物质量比1:50向其中加入胰液素， 启动模拟体外肠道消化， 同时磁力搅拌器搅拌， 模 拟肠部蠕动一段时间， 最后取出部分消化液B作为样本， 分析该骨肽在肠部的消化特性。 0020 优选的是， 所述的骨肽的成骨生理活性确证方法中， 所述步骤四中， 建立并模拟机 体Caco-

19、2小肠上皮细胞单层膜吸收模型的具体步骤包括： 0021 首先将Caco-2细胞细胞悬浮液， 接种至培养小室， 向培养小室顶侧AP加入细胞悬 液， 向培养小室底侧加入完全培养基， 培养一段时间后， 测定跨膜电阻值， 以跨膜电阻值为 参考指标， 连续培养细胞1215天直至跨膜电阻值达到最大值时， 表明Caco-2小肠上皮细 胞单层膜吸收模型构建成功； 0022 Caco-2细胞单层膜模型构建成功后， 进行骨肽的吸收转运试验： 用HBSS缓冲液清 洗细胞单层膜2次， 分别向AP、 BP两侧加入0.5mL、 1.5mL含0.05DMSO的HBSS缓冲液， 然后于 体积比5CO2、 95空气和温度37恒

20、温培养30min， 然后除去缓冲液， 向AP侧加入0.5mL 10mM骨肽， BL侧加入1.5mL含0.05DMSO的HBSS缓冲液， 继续于体积比5CO2、 95空气和 温度37恒温培养； 0023 其余组， 在加入骨肽之前， 首先向AP、 BP侧分别加入0.5mL、 1.5mL与细胞吸收转运 相关通路促进剂和抑制剂： 浓度为0.5 g/mL的细胞松弛素D、 500nM的渥曼青霉素、 25mM的 Gly-Sar， 以分析其吸收转运机制， 同样培养30min后， 除去缓冲液， 再分别向AP侧加入0.5mL 10mM骨肽溶液， 向BP侧加入1.5mL含0.05DMSO的HBSS缓冲液， 2h后从

21、BL侧取样100 L， 放 说明书 2/13 页 5 CN 110950930 A 5 置-20保存用于检测。 0024 优选的是， 所述的骨肽的成骨生理活性确证方法中， 还包括对骨肽进行序列分析 以获得其序列的步骤； 0025 所述步骤一中， 利用AlgPred在线数据库预测骨肽的潜在致敏性； 步骤二中， 胃蛋 白酶与骨肽的质量比为1:50， 胰液素与骨肽的质量比也为1:50。 0026 优选的是， 所述的骨肽的成骨生理活性确证方法中， 所述胃部微环境模型于胃部 模拟容器中进行， 所述胃部模拟容器包括外周壁和与所述外周壁封闭连接的底部， 所述外 周壁由柔性材料制成， 在所述外周壁上相对的两侧

22、设置有一对挤压部， 所述挤压部配置成 通过同时对其进行压缩操作， 而使所述外周壁在其径向上扁平化， 于所述外周壁内沿其径 向设置有复位弹簧， 所述复位弹簧的两端对应于所述一对挤压部的位置处固定于所述外周 壁的内侧， 其中， 所述外周壁在俯视观察下的形状呈椭圆形， 所述一对挤压部和复位弹簧沿 椭圆的长轴设置， 且所述一对挤压部和复位弹簧位于所述胃部模拟容器的下侧， 在竖直方 向上距离所述底部的高度不超过所述胃部模拟容器总高度的1/3。 本发明的胃部模拟容器 的外周壁采用柔性材质， 且设置有挤压部和复位弹簧， 可根据需要按压挤压部使其模拟胃 部蠕动， 从而能够更好地模拟胃部的实际工作环境， 以利于

23、取得更加真实的结果。 0027 优选的是， 所述的骨肽的成骨生理活性确证方法中， 步骤五中， 基于Real-time qPCR和Western blot方法分析所述骨肽对Wnt/ -catenin通路存在的影响， 其中， Real- time qPCR中检测基因的引物包含如SEQ ID NO： 2和SEQ ID NO： 3所示的引物对， 如SEQ ID NO： 4和SEQ ID NO： 5所示的引物对， SEQ ID NO： 6和SEQ ID NO： 6所示的引物对， SEQ ID NO： 8和SEQ ID NO： 9所示的引物对， SEQ ID NO： 10和SEQ ID NO： 11所示的

24、引物对， 如SEQ ID NO： 12和SEQ ID NO： 13所示的引物对， SEQ ID NO： 14和SEQ ID NO： 15所示的引物对， SEQ ID NO： 16和SEQ ID NO： 17所示的引物对， SEQ ID NO： 18和SEQ ID NO： 19所示的引物对。 0028 所述的骨肽在科学研究或成骨研究活性功能食品制作中的用途。 0029 本发明至少包括以下有益效果： 0030 本发明率先通过生物信息学、 胃肠道消化模型、 Caco-2小肠上皮细胞吸收模型， 系 统研究其体外致敏性、 消化、 吸收、 转运及成骨活性作用机制确证方法， 从而明确其作为成 骨活性功能食品

25、添加剂的潜在可行性。 在考虑应用骨肽作为成骨活性功能食品添加剂的同 时， 系统评价了其是否具有抗原免疫性、 胃肠消化稳定性、 可运载性及靶向成骨活性功能。 本发明的方法具有较好的预测和评价多肽的成骨生理活性的能力， 可为指导今后利用畜禽 骨胶原蛋白肽开发生物活性功能食品提供理论依据。 0031 本发明的其它优点、 目标和特征将部分通过下面的说明体现， 部分还将通过对本 发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。 附图说明 0032 图1A为本发明其中一个实施例中构建的胃肠道消化吸收模型示意图； 图1B为俯视 观察下的胃部模拟容器的结构示意图； 0033 图2本发明其中一个实施例中构建的Cac

26、o-2细胞单层膜转运模型示意图； 0034 图3为本发明其中一个实施例中的骨肽经模拟胃肠道消化吸收后组分分析图； 0035 图4为本发明其中一个实施例中的骨肽经Caco-2细胞内肽酶消化后组分分析图； 说明书 3/13 页 6 CN 110950930 A 6 0036 图5A为本发明其中一个实施例中的骨肽可能的三种转运机制条件下表观吸收系 数比较分析图； 0037 图5B为本发明其中一个实施例中的骨肽跨Caco-2细胞单层膜转运机制分析图； 0038 图6A为本发明其中一个实施例中的骨肽对成骨细胞增殖相关基因表达量的影响； 0039 图6B为本发明其中一个实施例中的骨肽对成骨细胞Wnt/ -

27、catenin通路相关基因 表达量的影响； 0040 图6C为本发明其中一个实施例中的骨肽对成骨细胞增殖相关基因蛋白表达的 Western blot电泳图； 0041 图6D为本发明其中一个实施例中的骨肽对成骨细胞增殖相关基因蛋白表达量的 影响； 0042 图6E为本发明其中一个实施例中的骨肽对成骨细胞Wnt/ -catenin通路相关基因 蛋白表达的Western blot电泳图； 0043 图6F为本发明其中一个实施例中的骨肽对成骨细胞Wnt/ -catenin通路相关基因 蛋白表达量的影响； 0044 图7为本发明其中一个实施例中的骨肽促成骨细胞增殖活性机制分析图； 0045 图8为本发

28、明其中一个实施例中骨肽的制备及成骨生理活性确认方法的流程示意 图。 具体实施方式 0046 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明， 以令本领域技术人员参照说明书文 字能够据以实施。 0047 应当理解， 本文所使用的诸如 “具有” 、“包含” 以及 “包括” 术语并不配出一个或多 个其它元件或其组合的存在或添加。 0048 申请人实验室从牛骨中分离、 纯化制备得到较高纯度的牛骨胶原蛋白肽， 并对其 氨基酸序列进行结构鉴定， 构建了促成骨细胞增殖活性(成骨活性)肽库， 依据与靶点蛋白 结合力类型、 结合位点氨基酸残基个数和种类明确了成骨活性肽氨基酸序列结构特征。 然 而， 牛骨胶原蛋白肽的促成

29、骨细胞增殖生理活性取决于其完整到达靶点的能力， 目前尚未 见系统评价和确证骨肽的成骨生理活性研究报道， 极大地限制了其开发和利用。 0049 本发明提供一种骨肽， 所述骨肽具有成骨活性， 所述骨肽的氨基酸序列如SEQ ID NO： 1所示。 0050 本发明提供一种骨肽的成骨生理活性确证方法， 包括： 0051 一种骨肽的成骨生理活性确证方法， 包括依次进行的如下步骤： 0052 步骤一、 利用生物信息学方法预测骨肽的潜在致敏性， 分析骨肽的抗原免疫性； 0053 步骤二、 建立并模拟机体胃部微环境模型， 分析骨肽在胃部消化特性； 0054 步骤三、 建立并模拟机体肠部微环境模型， 分析骨肽在

30、肠部消化特性； 0055 步骤四、 建立并模拟机体Caco-2小肠上皮细胞单层膜吸收模型， 分析骨肽在小肠 上皮细胞的可运载特性； 0056 步骤五、 分析所述骨肽对Wnt/ -catenin通路的影响。 0057 若所述骨肽能够满足较低抗原免疫性， 对胃肠部消化具有一定耐受性， 可经过在 说明书 4/13 页 7 CN 110950930 A 7 小肠上皮细胞运载至作用靶点(可运载性)， 且可激活机体内Wnt/ -catenin信号通路， 则该 骨肽能用于功能食品中。 0058 如图1所示， 胃液装置1和肠液装置2可通过各自的导管3、 4连通至放置于磁力搅拌 装置上的胃部模拟容器或肠部模拟容

31、器中， 打开流量开关5即可实现液体流动， 从而建立好 机体胃部微环境模型和机体肠部微环境模型， 通过pH探针6可测定溶液的pH， 反应装置中设 置有转子7。 0059 本发明率先通过生物信息学、 胃肠道消化模型、 Caco-2小肠上皮细胞吸收模型， 系 统研究其体外致敏性、 消化、 吸收、 转运及成骨活性作用机制确证方法， 从而明确其作为成 骨活性功能食品添加剂的潜在可行性。 在考虑应用骨肽作为成骨活性功能食品添加剂的同 时， 系统评价了其是否具有抗原免疫性、 胃肠消化稳定性、 可运载性及靶向成骨活性功能。 本发明的方法具有较好的预测和评价多肽的成骨生理活性的能力， 可为指导今后利用畜禽 骨胶

32、原蛋白肽开发生物活性功能食品提供理论依据。 0060 在本发明的其中一个实施例中， 作为优选， 所述步骤二中， 建立并模拟机体胃部微 环境模型的具体步骤包括： 首先配置骨肽溶液， 之后将骨肽溶液置于37恒温水环境中， 然 后调节骨肽溶液pH至2.0， 再向其中加入胃蛋白酶， 启动模拟体外胃部消化， 同时磁力搅拌 器搅拌， 模拟胃部蠕动一段时间， 最后取出部分消化液A作为样本， 分析该骨肽在胃部的消 化特性。 0061 在本发明的其中一个实施例中， 作为优选， 所述步骤三中， 建立并模拟机体肠部微 环境模型的具体步骤包括： 首先将步骤二中剩余的溶液的pH调节至7.5， 之后按照酶与底物 质量比1

33、:50向其中加入胰液素， 启动模拟体外肠道消化， 同时磁力搅拌器搅拌， 模拟肠部蠕 动一段时间， 最后取出部分消化液B作为样本， 分析该骨肽在肠部的消化特性。 0062 在本发明的其中一个实施例中， 作为优选， 所述步骤四中， 建立并模拟机体Caco-2 小肠上皮细胞单层膜吸收模型的具体步骤包括： 0063 首先将Caco-2细胞细胞悬浮液， 接种至培养小室， 向培养小室顶侧AP加入细胞悬 液， 向培养小室底侧加入完全培养基， 培养一段时间后， 测定跨膜电阻值， 以跨膜电阻值为 参考指标， 连续培养细胞1215天直至跨膜电阻值达到最大值时， 表明Caco-2小肠上皮细 胞单层膜吸收模型构建成功

34、。 0064 Caco-2细胞单层膜模型构建成功后， 进行骨肽的吸收转运试验： 用HBSS缓冲液清 洗细胞单层膜2次， 分别向AP、 BP两侧加入0.5mL、 1.5mL含0.05DMSO的HBSS缓冲液， 然后于 体积比5CO2、 95空气和温度37恒温培养30min， 然后除去缓冲液， 向AP侧加入0.5mL 10mM骨肽， BL侧加入1.5mL含0.05DMSO的HBSS缓冲液， 继续于体积比5CO2、 95空气和 温度37恒温培养； 0065 其余组， 在加入骨肽之前， 首先向AP、 BP侧分别加入0.5mL、 1.5mL与细胞吸收转运 相关通路促进剂和抑制剂： 浓度为0.5 g/mL

35、的细胞松弛素D、 500nM的渥曼青霉素、 25mM的 Gly-Sar， 以分析其吸收转运机制， 同样培养30min后， 除去缓冲液， 再分别向AP侧加入0.5mL 10mM骨肽溶液， 向BP侧加入1.5mL含0.05DMSO的HBSS缓冲液， 2h后从BL侧取样100 L， 放 置-20保存用于检测。 0066 在本发明的其中一个实施例中， 作为优选， 还包括对骨肽进行序列分析以获得其 序列的步骤； 说明书 5/13 页 8 CN 110950930 A 8 0067 所述步骤一中， 利用AlgPred在线数据库预测骨肽的潜在致敏性。 0068 在本发明的其中一个实施例中， 作为优选， 胃蛋

36、白酶与骨肽的质量比为1:50， 胰液 素与骨肽的质量比也为1:50。 0069 在本发明的其中一个实施例中， 作为优选， 所述胃部微环境模型于胃部模拟容器8 中进行， 所述胃部模拟容器8包括外周壁801和与所述外周壁封闭连接的底部， 底部可为玻 璃或者其他材质， 所述外周壁801由柔性材料制成， 在所述外周壁801上相对的两侧设置有 一对挤压部802a， 802b， 所述挤压部配置成通过同时对其进行压缩操作， 而使所述外周壁 801在其径向上扁平化， 于所述外周壁801内沿其径向设置有复位弹簧803， 所述复位弹簧 803的两端对应于所述一对挤压部的位置处固定于所述外周壁801的内侧， 其中，

37、 所述外周 壁801在俯视观察下的形状呈椭圆形， 所述一对挤压部802a， 802b和复位弹簧803沿椭圆的 长轴设置， 且所述一对挤压部802a， 802b和复位弹簧803位于所述胃部模拟容器8的下方， 在 竖直方向上距离所述底部的高度不超过所述胃部模拟容器总高度的1/3。 0070 在本发明的其中一个实施例中， 作为优选， 步骤五中， 基于Real-time qPCR和 Westernblot方法分析所述骨肽对Wnt/ -catenin通路存在的影响， 其中， Real-time qPCR 中检测基因的引物包含如SEQ ID NO： 2和SEQ ID NO： 3所示的引物对， 如SEQ I

38、D NO： 4和SEQ ID NO： 5所示的引物对， SEQ ID NO： 6和SEQ ID NO： 6所示的引物对， SEQ ID NO： 8和SEQ ID NO： 9所示的引物对， SEQ ID NO： 10和SEQ ID NO： 11所示的引物对， 如SEQ ID NO： 12和SEQ ID NO： 13所示的引物对， SEQ ID NO： 14和SEQ ID NO： 15所示的引物对， SEQ ID NO： 16和SEQ ID NO： 17所示的引物对， SEQ ID NO： 18和SEQ ID NO： 19所示的引物对。 0071 在本发明的其中一个实施例中， 作为优选， 所述一定

39、耐受性是骨肽在胃部消化后 仍存在完整的肽段。 0072 本发明首次公开了通过生物信息学、 胃肠道消化模型和Caco-2小肠上皮细胞吸收 模型系统评价骨肽的抗原免疫性、 胃肠稳定性、 可运载性及靶向成骨活性的方法。 此方法具 有较好的预测和评价多肽的成骨生理活性的能力， 可为指导今后利用畜禽骨胶原蛋白肽开 发生物活性功能食品提供理论依据。 0073 在本发明的其中一个实施例中， 一种骨肽的成骨生理活性确证方法， 包含以下主 要步骤： 0074 步骤一、 利用生物信息学预测多肽的潜在致敏性， 考查骨肽的抗原免疫性； 0075 步骤二、 建立并模拟机体胃部微环境模型， 考查骨肽在胃部消化特性； 00

40、76 步骤三、 建立并模拟机体肠部微环境模型， 考查骨肽在肠部消化特性； 0077 步骤四、 建立并模拟机体Caco-2小肠上皮细胞单层膜吸收模型， 分析骨肽在小肠 上皮细胞的可运载特性； 0078 步骤五、 基于Real-time qPCR和Western blot技术考查骨肽对Wnt/ -catenin通 路的影响。 0079 本发明所述骨肽的成骨生理活性确证方法中， 利用生物信息学预测多肽的潜在致 敏性的方式为AlgPred在线数据库预测(http:/ submission.html)。 0080 本发明所述骨肽的成骨生理活性确证方法中， 建立并模拟机体胃部和肠部微环境 模型为： 准确称

41、取骨肽(100mg)于100mL烧杯中， 加入5mL超纯水均质搅拌配置成20mg/mL浓 说明书 6/13 页 9 CN 110950930 A 9 度的骨肽溶液， 置于37恒温水浴锅， 用2M HCl溶液调节其pH至2.0； 加入胃蛋白酶(E/S为 1:50)启动模拟体外胃部消化， 磁力搅拌器搅拌(模拟胃部蠕动)2h后， 取出部分消化液A备 用。 其余反应液， 首先用0.5M NaHCO3溶液调节pH至5.3， 然后用2MNaOH溶液调节pH至7.5； 加 入胰液素(E/S为1:50)启动模拟体外肠道消化， 磁力搅拌器搅拌(模拟肠部蠕动)2h后， 取出 部分消化液B备用； 上述所有操作重复试

42、验3次。 将收集消化液A、 B分别经95恒温水浴加热 10min灭酶， 4、 8000g离心20min， 上清液经冷冻干燥机冻干后保存于-20以备后续分 析。 0081 本发明所述骨肽的成骨生理活性确证方法中建立并模拟机体Caco-2小肠上皮细 胞单层膜吸收模型为： 将Caco-2细胞消化后制备成浓度为2105cells/mL细胞悬浮液， 接 种至12孔培养小室， 缓慢向培养小室顶侧AP(Apical side)加入500 L细胞悬液， 细胞接种 量1.5105cells/insert， 同时向培养小室BL(Basolateral side)侧缓慢加入完全培养基 1.5mL。 在Caco-2细

43、胞接种后第三天更换AP、 BL两侧培养基， 以后每2天更换一次培养基， 一 周后每天更换培养基直至10-15天。 注意， 更换培养液时首先小心缓慢吸走培养小室BL侧培 养液再快速移去AP侧培养液， 加培养基时顺序先加AP侧后加BL侧。 0082 使用Millicecll ERS-2型电阻仪对Caco-2细胞单层模型两侧电阻值进行测定， 将 电极较短的一端插入Transwell insert培养小室的内部(AP侧)， 长端浸入外部(BL侧)， 短 端严禁触碰Caco-2细胞单层膜上生长的细胞， 长端垂直于培养板底侧， 确保电极平稳， 待仪 器示数稳定后准确记录电阻值。 Caco-2细胞单层膜的跨

44、膜电阻以单位膜面积跨膜电阻(* cm2)表示： 0083 Caco-2细胞跨膜电阻(*cm2)(10)0.3 0084 其中， 1为有Caco-2细胞生长时的跨膜电阻值； 0为无Caco-2细胞生长时的空白 电阻值； 0.3为24孔Tanswell insert小室膜面积。 0085 以跨膜电阻值为参考指标， 测定不同天数(每2天测定一次， 如1、 3、 5)电阻值 并记录数据， 保证模型构建成功， 约12天。 0086 步骤四中为了考查骨肽跨膜转运特性及机制， 采用了不同的小分子物质转运通路 抑制剂和促进剂， 具体试验设计如下： 0087 Caco-2细胞单层膜模型构建成功后， 进行骨肽GP

45、-12的吸收转运试验。 用HBSS缓冲 液清洗细胞单层膜2次， 分别向AP、 BP两侧加入0.5mL、 1.5mL含0.05DMSO的HBSS缓冲液， 5CO2、 95空气、 37恒温培养箱(Stericycle CO2incubator,Thermo FisherScientific Inc.,Waltham,MA)培养30min， 除去缓冲液， 向AP侧加入0.5mL 10mM骨肽GP-12溶液(含 0.05DMSO的HBSS缓冲液配制， 下同)， BL侧加入1.5mL含0.05DMSO的HBSS缓冲液， 5 CO2、 95空气、 37恒温培养箱培养。 0088 其余组， 在加入骨肽之前，

46、 向AP、 BP侧分别加入0.5mL、 1.5mL与细胞吸收转运相关 通路促进剂和抑制剂： 细胞松弛素D(细胞旁路吸收促进剂)、 渥曼青霉素(内吞作用抑制 剂)、 Gly-Sar(PepT1载体底物)以考查其吸收转运机制。 促进剂和抑制剂用含0.05DMSO的 HBSS缓冲液溶解， 浓度分别为0.5 g/mL(细胞松弛素D)、 500nM(渥曼青霉素)、 25mM(Gly- Sar)。 培养30min后， 除去缓冲液， 分别向AP侧加入0.5mL 10mM骨肽溶液， 向BP侧加入1.5mL 含0.05DMSO的HBSS缓冲液， 2h后从BL侧取样100 L， 放置-20保存待测， 上述所有操作

47、重 复试验3次。 说明书 7/13 页 10 CN 110950930 A 10 0089 优选的是， 上述步骤二、 步骤三和步骤四中经模拟胃肠道消化及Caco-2细胞单层 膜转运试验后的溶液中多肽的组成、 氨基酸序列及相应含量分析采用以下方法进行序列鉴 定： 0090 采用安捷伦HPLC1260-II系统(Agilent Technologies Inc.,California,USA)对 骨肽经模拟胃肠道消化后组分含量进行测定。 TSK gel G2000SWXL色谱柱(7.8300mm, TOSOH,Tokyo,Japan)； 流动相A为体积分数为0.1的三氟乙酸水溶液， 流动相B为体积

48、分数 为0 .1的三氟乙酸的乙腈溶液。 骨肽模拟胃肠道消化后组分经反向毛细管色谱柱 (Phenomenex,10cm,5 m C18USA)加载至高分辨率质谱仪(Thermo Q- Exactive,Thermo Scientific,USA)。 质谱参数设置如下： 电喷雾离子源(ESI)； 扫描方式， 正离子模式； 毛细管温度320， 毛细管喷射电压为2kV。 高分辨率MS/MS全扫描(m/z 300- 2000Da)， 10eV电子能量碰撞解离。 基于Mascot 2.4search engine(Matrix Science, Boston,USA)进行Swiss-Prot数据库检索比对

49、。 0091 基于Real-time qPCR和Western blot技术考查骨肽对Wnt/ -catenin通路的影响 具体操作步骤如下： 0092 取适量细胞悬浊液于RNAase-free的1.5mL EP管中， 按0.2mL/1.0mL TRIzol比例 加入氯仿， 强烈震荡20s， 室温静置5min， 4、 12000g离心15min， 转移上层溶液至新的 1.5mLEP管中； 加入异丙醇0.5mL/1.0mL TRIzol， 混匀后室温放置10min， 4、 10000g离心 10min； 弃去上清， 沉淀即为RNA， 向沉淀中加入1mL75乙醇(-20预冷)， 4、 10000g

50、离 心8min， 弃上清； 震荡清洗沉淀后， 4、 10000g离心3min， 小心移除上清， 注意不要将RNA 沉淀移除； 室温放置2-3分钟， 晾干。 加入100 L RNase-free水， 充分溶解RNA， 得到的RNA保 存在-80备用。 采用微量核酸蛋白测定仪测定RNA浓度并电泳测定其含量。 取上述RNA样 品， 用RNase-free水将其浓度稀释至100ng/ L， 按下表加样(总反应体积以10 L计)： 0093 0094 逆转录反应条件如下： 37、 15min； 85、 5s加热灭酶(逆转录酶)， 反应结束后， 将 反转录获得的cDNA溶液稀释100倍， 按下表配制反应液