多重检测呼吸道病毒核酸的方法及试剂盒.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010980496.9 (22)申请日 2020.09.17 (71)申请人 中山大学达安基因股份有限公司 地址 510665 广东省广州市高新技术开发 区香山路19号 (72)发明人 蒋析文黄桃生李欣钰黄志文 林卫萍 (74)专利代理机构 上海助之鑫知识产权代理有 限公司 31328 代理人 陈详 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.0

2、1) (54)发明名称 多重检测呼吸道病毒核酸的方法及试剂盒 (57)摘要 本发明提供了多重检测呼吸道病毒核酸的 方法及试剂盒， 具体地本发明公开了一种基于实 时荧光定量PCR技术平台， 多重检测H1N1(2019)、 H3N2、 H5N1、 H1N1、 H7N9等甲型流感病毒， Yamagata、 Victoria等乙型流感病毒， 2019nCoV OFR1ab、 N基因及人源内标基因GAPDH的方法、 引 物、 探针及其试剂盒， 具有检测操作简单、 绝对定 量、 灵敏度高、 特异性强及重复性好等优点。 权利要求书2页 说明书19页 序列表4页 附图5页 CN 112063756 A 202

3、0.12.11 CN 112063756 A 1.一种用于多重检测呼吸道病毒核酸的引物对集， 其特征在于， 所述引物对集包括： 第一引物对组， 所述第一引物对组包括如SEQ ID NO.5所示的正向引物； 和， 如SEQ ID NO.6所示的反向引物； 第二引物对组， 所述第二引物对组包括如SEQ ID NO.7所示的正向引物； 和， 如SEQ ID NO.8所示的反向引物； 第三引物对组， 所述第三引物对组包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物； 和， 如SEQ ID NO.2所示的反向引物； 和 第四引物对组， 所述第四引物对组包括如SEQ ID NO.3所示的正向引物； 和， 如SE

4、Q ID NO.4所示的反向引物。 2.如权利要求1所述的引物对集， 其特征在于， 所述引物对集还包括： 第五引物对组， 所述第五引物对组包括如SEQ ID NO.9所示的正向引物； 和， 如SEQ ID NO.10所示的反向引物。 3.一种检测呼吸道病毒核酸的探针集， 其特征在于， 所述探针集包括： 选自下组的一种或多种检测探针： SEQ ID NO.11、 SEQ ID NO.12、 SEQ ID NO.13、 SEQ ID NO.14、 SEQ ID NO.15。 4.一种多重检测呼吸道病毒核酸的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括权利要求1所 述的引物对集； 和/或 所述试剂盒还包括

5、权利要求3所述的探针集。 5.如权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括第一容器， 所述第一容器 内包含引物探针混合液， 所述引物探针混合液中包含多种引物和多种探针， 其中所述引物 包括多核苷酸序列分别如SEQ ID NO： 1、 SEQ ID NO： 2、 SEQ ID NO： 3、 SEQ ID NO： 4、 SEQ ID NO： 5、 SEQ ID NO： 6、 SEQ ID NO： 7、 和SEQ ID NO： 8所示的引物； 所述探针包括分别具有SEQ ID NO： 11、 SEQ ID NO： 12、 SEQ ID NO： 13、 和SEQ ID NO： 14所示的多

6、核苷酸序列的探针。 6.如权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述引物探针混合液中还包含多核苷酸序 列分别如SEQ ID NO： 9、 和SEQ ID NO： 10所示的引物； 以及， 具有SEQ ID NO： 15所示的多核 苷酸序列的探针。 7.如权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括第二容器， 所述第二容 器内包含热启动Taq酶、 逆转录酶、 和dNTPS。 8.一种检测呼吸道病毒核酸的方法， 其特征在于， 所述方法包括步骤： (1)提供待检测对象的核酸样本； (2)制备PCR反应体系并进行荧光定量PCR检测： 其中， 所述PCR反应体系包括： 步骤(1)提供的所述

7、核酸样本、 权利要求1所述的引物对 集、 和权利要求3所述的探针集。 9.如权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述PCR反应体系包括步骤(1)提供的所述核 酸样本和引物探针混合液， 所述引物探针混合液中包含多种引物和多种探针， 其中所述引 物包括多核苷酸序列分别如SEQ ID NO： 1、 SEQ ID NO： 2、 SEQ ID NO： 3、 SEQ ID NO： 4、 SEQ ID NO： 5、 SEQ ID NO： 6、 SEQ ID NO： 7、 和SEQ ID NO： 8所示的引物； 所述探针包括分别具有 SEQ ID NO： 11、 SEQ ID NO： 12、 SEQ ID

8、NO： 13、 和SEQ ID NO： 14所示的多核苷酸序列的探 针。 权利要求书 1/2 页 2 CN 112063756 A 2 10.权利要求1所述的引物对集、 和/或权利要求3所述的探针集的用途， 用于制备PCR检 测试剂盒， 所述PCR检测试剂盒用于检测呼吸道病毒核酸。 权利要求书 2/2 页 3 CN 112063756 A 3 多重检测呼吸道病毒核酸的方法及试剂盒 技术领域 0001 本发明属于生物技术和肿瘤诊断领域， 具体地说， 本发明涉及一种基于实时荧光 定量PCR检测技术平台， 定性检测人鼻咽拭子、 咽拭子、 痰液等样本中甲型流感病毒、 乙型流 感病毒及2019新型冠状病

9、毒核酸检测的方法、 引物、 探针及包括该引物探针混合液的试剂 盒。 背景技术 0002 甲型流感病毒是由A型流感病毒(Influenza A)引起的一种人畜共患的疾病综合 症。 禽类感染Influenza A后， 可出现从亚临床症状到轻度上呼吸道症状、 委顿、 乃至全身致 死性疾病综合征。 目前已有许多甲型流感病毒如H1N1、 H3N2、 H5N1、 H9N2、 H7N9等由禽类传播 到人类中， 死亡率极高， 导致严重的公共卫生事件， 不同型别的毒株感染在临床症状上高度 类似， 并且与造成流感样症状的其他病原也难以区别。 监测是确定甲型流感流行株、 发现变 异株、 预测和防控疫情的基础。 因此

10、， 建立快速、 准确、 简单、 高灵敏度的检测方法显得尤为 迫切。 0003 乙型流感病毒(Influenza B virus)是流感的主要病原之一， 主要经飞沫及接触 传播， 人群普遍敏感。 乙型流感病毒引起的症状特点是起病急骤， 畏寒、 发热， 体温在数小时 至24小时内升达高峰， 39-40甚至更高； 伴头痛， 全身酸痛， 乏力， 食欲减退； 呼吸道症状较 轻， 咽干喉痛， 干咳， 可有腹泻； 颜面潮红， 眼结膜外眦充血， 咽部充血， 软腭上有滤泡。 乙型 流感病毒根据抗原特性和血凝素(HA1)基因的核酸序列， 可以分为不同的谱系。 病毒大多数 的谱系在自然选择中消失， 目前演变成抗原性

11、差异较大的两大谱系， 分别称为Yamagata系 和Victoria系(简称为Y系和V系)。 0004 2019新型冠状病毒(2019-nCoV或SARS-CoV-2)， 为不分节段的单股正链RNA病毒， 属于巢病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Corona viridae)正冠状病毒亚科(Orthocorona mirinae)， 根据血清型和基因组特点冠状病毒亚科被分为四个属。 该病毒对热敏感， 5630 分钟、 75乙醇、 含氯消毒剂、 过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭活病毒， 氯已定不能有 效灭活病毒。 临床症状以发热、 乏力、 干咳为主要表现。 鼻塞、 流涕等上呼吸道症状少

12、见。 约 半数患者多在一周后出现呼吸困难， 严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、 脓毒症休克、 难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。 值得注意的是重症、 危重症患者病程中可为 中低热， 甚至无明显发热部分患者起病症状轻微， 可无发热， 多在1周后恢复多数恵者预后 良好， 少数患者病情危重， 甚至死亡。 0005 甲型流感病毒、 乙型流感病毒、 2019新型冠状病毒均为呼吸道病毒。 甲型流感病毒 和乙型流感病毒是最常见的流感病原， 感染者初期症状与2019新型冠状病毒感染症状极为 相似， 均会表现出发热、 咳嗽等症状， 因此难以从临床症状对患者进行准确的鉴别诊断。 0006 目前， 甲型流感

13、病毒、 乙型流感病毒及2019新型冠状病毒核酸常用的检测方法包 括基于荧光PCR技术的单一病原体的检测技术、 高通量测序法、 恒温扩增等， 荧光PCR技术检 测特异性高、 灵敏度强操作较为简单， 但在对多个病原同时进行检测时常需分管进行针对 说明书 1/19 页 4 CN 112063756 A 4 性检测， 不同病原体PCR扩增条件可能存在一定的差异， 因此临床应用时需逐一排查， 导致 病原确定的周期加长， 高通量测序技术虽然可同时对多种未知序列进行检测， 但存在检测 周期长、 成本高昂且操作复杂、 数据解读难等问题， 而恒温扩增技术虽然检测时间短， 但其 检测设备并不成熟， 临床试剂应用时

14、需增够新型仪器才能进行配套检测。 0007 因此， 本领域迫切需要开发能够高效率检测、 鉴别临床常见呼吸道病毒的方法以 满足临床的需求。 另外， 有报道表明现有的临床使用的核酸检测试剂盒存在准确率较低的 问题， 因此需要开发具有较高的临床检测准确率的试剂盒产品。 发明内容 0008 本发明的目的在于提供一种多重检测呼吸道病毒核酸的方法及试剂盒。 0009 在本发明的第一方面， 提供了一种用于多重检测呼吸道病毒核酸的引物对集， 所 述引物对集包括： 0010 第一引物对组， 所述第一引物对组包括如SEQ ID NO.5所示的正向引物； 和， 如SEQ ID NO.6所示的反向引物。 0011 在

15、另一优选例中， 所述引物对集还包括： 0012 第二引物对组， 所述第二引物对组包括如SEQ ID NO.7所示的正向引物； 和， 如SEQ ID NO.8所示的反向引物。 0013 在另一优选例中， 所述引物对集还包括： 0014 第三引物对组， 所述第三引物对组包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物； 和， 如SEQ ID NO.2所示的反向引物。 0015 在另一优选例中， 所述引物对集还包括： 0016 第四引物对组， 所述第四引物对组包括如SEQ ID NO.3所示的正向引物； 和， 如SEQ ID NO.4所示的反向引物。 0017 在另一优选例中， 所述引物对集还包括： 00

16、18 第五引物对组， 所述第五引物对组包括如SEQ ID NO.9所示的正向引物； 和， 如SEQ ID NO.10所示的反向引物。 0019 本发明的第二方面， 提供了一种检测呼吸道病毒核酸的探针集， 所述探针集包括： 0020 选自下组的一种或多种检测探针： SEQ ID NO.11、 SEQ ID NO.12、 SEQ ID NO.13、 SEQ ID NO.14、 SEQ ID NO.15。 0021 在另一优选例中， 各探针的5 端包含有荧光报告基团； 和/或， 各探针的3 端包含 有荧光淬灭基团。 0022 在另一优选例中， 各探针标记的荧光报告基团互不相同。 0023 本发明的第

17、三方面， 提供了一种多重检测呼吸道病毒核酸的试剂盒， 所述试剂盒 包括本发明第一方面所述的引物对集。 0024 在另一优选例中， 所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针集。 0025 在另一优选例中， 所述试剂盒包括第一容器， 所述第一容器内包含引物探针混合 液， 所述引物探针混合液中包含多种引物和多种探针， 其中所述引物包括多核苷酸序列分 别如SEQ ID NO： 1、 SEQ ID NO： 2、 SEQ ID NO： 3、 SEQ ID NO： 4、 SEQ ID NO： 5、 SEQ ID NO： 6、 SEQ ID NO： 7、 和SEQ ID NO： 8所示的引物； 所述探针包括分

18、别具有SEQ ID NO： 11、 SEQ ID 说明书 2/19 页 5 CN 112063756 A 5 NO： 12、 SEQ ID NO： 13、 和SEQ ID NO： 14所示的多核苷酸序列的探针。 0026 在另一优选例中， 所述第一容器还包括5RNA buffer和DEPC水。 0027 在另一优选例中， 所述引物探针混合液中还包含多核苷酸序列分别如SEQ ID NO： 9、 和SEQ ID NO： 10所示的引物； 以及， 具有SEQ ID NO： 15所示的多核苷酸序列的探针。 0028 在另一优选例中， 各探针标记的荧光报告基团互不相同。 0029 在另一优选例中， 所述

19、试剂盒还包括第二容器， 所述第二容器内包含热启动Taq 酶、 逆转录酶、 和dNTPS。 0030 在另一优选例中， 所述试剂盒还包括第三容器， 所述第三容器内包含阳性对照。 优 选地， 所述阳性对照包括具有甲型流感病毒基因、 乙型流感病毒基因、 2019-nCoV ORF1ab基 因、 2019-nCoV N基因及内标GAPDH基因的病毒样颗粒。 0031 在另一优选例中， 所述试剂盒还包括第四容器， 所述第四容器内包含阴性对照。 优 选地， 所述阴性对照为纯水。 0032 本发明的第四方面， 提供了一种检测呼吸道病毒核酸的方法， 所述方法包括步骤： 0033 (1)提供待检测对象的核酸样本

20、； 0034 (2)制备PCR反应体系并进行荧光定量PCR检测： 0035 其中， 所述PCR反应体系包括： 步骤(1)提供的所述核酸样本、 本发明第一方面所述 的引物对集、 和本发明第二方面所述的探针集。 0036 在另一优选例中， 所述PCR反应体系包括步骤(1)提供的所述核酸样本和引物探针 混合液， 所述引物探针混合液中包含多种引物和多种探针， 其中所述引物包括多核苷酸序 列分别如SEQ ID NO： 1、 SEQ ID NO： 2、 SEQ ID NO： 3、 SEQ ID NO： 4、 SEQ ID NO： 5、 SEQ ID NO： 6、 SEQ ID NO： 7、 和SEQ ID

21、 NO： 8所示的引物； 所述探针包括分别具有SEQ ID NO： 11、 SEQ ID NO： 12、 SEQ ID NO： 13、 和SEQ ID NO： 14所示的多核苷酸序列的探针。 0037 在另一优选例中， 所述引物探针混合液中还包含多核苷酸序列分别如SEQ ID NO： 9、 和SEQ ID NO： 10所示的引物； 以及， 具有SEQ ID NO： 15所示的多核苷酸序列的探针。 0038 在另一优选例中， 各探针标记的荧光报告基团互不相同。 0039 在另一优选例中， 所述核酸样本可来自人鼻咽拭子、 咽拭子或痰液样本。 0040 在另一优选例中， 所述方法为非诊断目的的检测方

22、法。 0041 本发明的第五方面， 提供了本发明第一方面所述的引物对集、 和/或本发明第二方 面所述的探针集的用途， 用于制备PCR检测试剂盒， 所述PCR检测试剂盒用于检测呼吸道病 毒核酸。 0042 应理解， 在本发明范围内中， 本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合， 从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇幅， 在 此不再一一累述。 附图说明 0043 图1： 本发明检测阴性对照的结果示意图； 0044 图2： 本发明检测甲型流感病毒阳性对照的结果示意图； 0045 图3： 本发明检测乙型流感病毒阳性对照的结果示意图； 0046 图4： 本发

23、明检测2019新型冠状病毒ORF1ab基因阳性对照的结果示意图； 说明书 3/19 页 6 CN 112063756 A 6 0047 图5： 本发明检测2019新型冠状病毒N基因阳性对照的结果示意图； 0048 图6： 本发明检测甲型流感病毒、 乙型流感病毒、 2019新型冠状病毒阳性对照的结 果示意图； 0049 图7： 本发明2019-nCoV ORF1ab基因对照引物对1的特异性(甲流样本非特异性扩 增)检测结果示意图； 0050 图8： 本发明2019-nCoV ORF1ab基因对照引物对2的检测结果示意图； 0051 图9： 本发明2019-nCoV ORF1ab基因对照引物对3的

24、灵敏度检测结果示意图。 具体实施方式 0052 本发明人通过广泛而深入的研究， 获得一种多重检测呼吸道病毒核酸的方法及试 剂盒； 具体地， 本发明提供了一种基于实时荧光定量PCR技术平台， 多重检测疑似流感或新 型冠状病毒肺炎患者鼻咽拭子、 咽拭子或痰液等样本中H1N1(2019)、 H3N2、 H5N1、 H1N1、 H7N9 等甲型流感病毒、 Yamagata、 Victoria等乙型流感病毒、 2019-nCoVOFR1ab、 N基因及人源内 标基因GAPDH的方法、 引物、 探针及其试剂盒， 具有检测操作简单、 绝对定量、 灵敏度高、 特异 性强及重复性好等优点。 0053 荧光PCR

25、技术是临床病原体检测中最常用的技术之一， 然而由于各荧光通道之间 存在信号干扰较强的原因， 目前临床上常用的病原体检测多为单管单重检测， 本发明通过 大量的筛选优化测试， 最终将甲型流感病毒、 乙型流感病毒及2019新型冠状病毒的检测合 并到一个PCR反应管中， 采用5个不同的荧光通道对各病原体进行检测， 经优化测试将各通 道之间的干扰降到最低， 同时以人管家基因为内标， 对样本采集、 提取等过程进行监控， 有 效避免假阴性结果的产生。 0054 多重PCR(multiplex PCR)， 又称多重引物PCR或复合PCR， 它是在同一PCR反应体系 里加上二对以上引物， 同时扩增出多个核酸片段

26、的PCR反应， 其反应原理， 反应试剂和操作 过程与一般PCR相同。 0055 影响多重PCR反应的因素有很多， 比如： 0056 (1)反应体系不平衡， 反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物 及其模板迅速扩增， 获得大量的扩增产物， 而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制 剂。 所以， 随着扩增产物的大量出现， 聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制， 因此， 前期处 于劣势的引物及其模板， 这时就更加难以反应， 最终导致扩增产物量非常之小， 以至于无法 检测。 0057 (2)引物特异性， 如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强， 那么目的基 因结合引物的能力就会受到

27、竟争， 从而导致扩增效率下降。 0058 (3)最佳退火温度不一致， 将多对引物放置入一个体系中扩增， 由于进行PCR反应 的退火温度相同， 所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。 0059 (4)引物二聚体， 包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构， 还有一类 是第三方DNA介导的聚体， 这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的 竟争， 影响扩增效率。 0060 虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素， 但更多的因素尚不清楚。 到目前为止， 还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。 说明书 4/19 页 7 CN 112063756 A 7 0061 多重荧光PCR技术

28、能够在一个PCR反应管中对多种核酸分子进行定性检测， 在检测 甲型流感病毒、 乙型流感病毒及2019新型冠状病毒核酸时， 通过不同荧光标记的探针结合 特异扩增引物在一个PCR反应体系中， 统一的PCR扩增条件下实现多个病原的同时检测。 该 方法具有灵敏度高， 各荧光通道检测结果特异无信号串扰、 检测结果稳定、 操作简单且省时 等优点。 0062 应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件， 因为这类方法和条件可以变 动。 还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案， 并且不意图是限制性的， 本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。 0063 除非另外定义， 否则本文中所用的全部技术

29、与科学术语均具有如本发明所属领域 的普通技术人员通常理解的相同含义。 如本文所用， 在提到具体列举的数值中使用时， 术语 “约” 意指该值可以从列举的值变动不多于1。 例如， 如本文所用， 表述 “约100” 包括99和 101和之间的全部值(例如， 99.1、 99.2、 99.3、 99.4等)。 0064 虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法 和材料， 本文在此处例举优选的方法和材料。 0065 本发明提供了一种基于实时荧光PCR平台多重检测H1N1(2019)、 H3N2、 H5N1、 H1N1、 H7N9等甲型流感病毒， Yamagata、 Victo

30、ria等乙型流感病毒及2019-nCoV OFR1ab、 N基因及 人源内标基因GAPDH检测的方法、 引物、 探针及其试剂盒。 提供了用于检测2019-nCoV OFR1ab、 N基因检测所需的特异性引物、 探针及试剂盒预混液。 可以用于检测人鼻咽拭子、 咽 拭子或痰液样本。 0066 在一个优选地实施方式中， 所述引物包括针对H1N1(2019)、 H3N2、 H5N1、 H1N1、 H7N9 等甲型流感病毒， Yamagata、 Victoria等乙型流感病毒， 2019-nCoVOFR1ab、 N基因及人源内 标基因GAPDH的引物； 0067 其中， 针对H1N1(2019)、 H3

31、N2、 H5N1、 H1N1、 H7N9等甲型流感病毒的通用上游引物核 苷酸序列如SEQ ID NO： 1所示， 针对H1N1(2019)、 H3N2、 H5N1、 H1N1、 H7N9等甲型流感病毒的 通用下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO： 2所示； 0068 针对Yamagata、 Victoria乙型流感病毒的通用上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO： 3所示， 针对Yamagata、 Victoria乙型流感病毒的通用下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO： 4 所示； 0069 针对2019-nCoVOFR1ab基因的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO： 5所示， 针对

32、2019-nCoVOFR1ab基因的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO： 6所示； 0070 针对2019-nCoV N基因的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO： 7所示， 针对2019- nCoV N基因的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO： 8所示； 0071 针对内标GAPDH基因的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO： 9所示， 针对2019-nCoV N内标GAPDH基因的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO： 10所示。 0072 针对H1N1(2019)、 H3N2、 H5N1、 H1N1、 H7N9等甲型流感病毒的通用荧光探针核苷酸 序列如SEQ ID NO：

33、11所示； 0073 针对Yamagata、 Victoria等乙型流感病毒的通用荧光探针序列如SEQ ID NO： 12所 示； 0074 针对2019-nCoVOFR1ab基因的荧光探针序列如SEQ ID NO： 13所示； 说明书 5/19 页 8 CN 112063756 A 8 0075 针对2019-nCoV N基因的荧光探针序列如SEQ ID NO： 14所示； 0076 针对人管家基因GAPDH的荧光探针序列如SEQ ID NO： 15所示。 0077 进一步， 所述SEQ ID NO： 11核苷酸序列的5 端标记有FAM、 3 端标记有MGB， 所述 SEQ ID NO： 1

34、2核苷酸序列的5 端标记有TexasRed、 3 端标记有MGB， 所述SEQ ID NO： 13核苷 酸序列的5 端标记有VIC、 3 端标记有BHQ2， 所述SEQ ID NO： 14核苷酸序列的5 端标记有 TAMRA、 3 端标记有BHQ2， 所述SEQ ID NO： 15核苷酸序列的5 端标记有CY5、 3 端标记有MGB。 0078 优选地， 所述上游引物SEQ ID NO： 1和下游引物SEQ ID NO： 2， 在反应体系中的终 浓度为200nmol/L， 所述上游引物SEQ ID NO： 3、 上游引物SEQ ID NO： 9、 下游引物SEQ ID NO： 4和下游引物SE

35、Q ID NO： 10在反应体系中的终浓度为240nmol/L， 所述上游引物SEQ ID NO： 5、 上游引物SEQ ID NO： 7、 下游引物SEQ ID NO： 6和下游引物SEQ ID NO： 8在反应体系中 的终浓度为1000nmol/L， 所述探针SEQ ID NO： 11在反应体系中的终浓度为40nmol/L， 所述 探针序列SEQ ID NO： 12在反应体系中的终浓度为120nmol/L， 所述探针序列SEQ ID NO： 13 在反应体系中的终浓度为200nmol/L， 所述探针序列SEQ ID NO： 14在反应体系中的终浓度 为240nmol/L， 所述探针序列SE

36、Q ID NO： 15在反应体系中的终浓度为160nmol/L。 0079 H1N1(2019)、 H3N2、 H5N1、 H1N1、 H7N9等甲型流感病毒， Yamagata、 Victoria等乙型 流感病毒， 2019-nCoV OFR1ab、 N基因及人源内标基因GAPDH检测引物探针序列如下： 0080 说明书 6/19 页 9 CN 112063756 A 9 0081 0082 所述特异性引物和探针， 能够准确检测人是否感染甲型流感病毒、 乙型流感病毒 或2019新型冠状病毒。 同时对2019-nCoV ORF1ab和N基因进行检测， 对检测结果进行双重确 认， 以人管家基因G

37、APDH为内标， 对核酸质量进行监控， 在确定样本质量合格的情况下对新 型冠状病毒疑似感染者进行检测确诊。 0083 上述特异性引物和探针所制备的试剂盒， 基于临床常用荧光PCR平台在一个PCR反 应管中可同时检测甲型流感病毒、 乙型流感病毒、 2019-nCoV ORF1ab和N基因， 为患者的及 时确诊及隔离治疗提供确诊依据。 0084 在本发明的一个优选地实施方式中， 本发明还公开了一种人鼻咽拭子、 咽拭子或 痰液样本核酸2019-nCoV核酸检测试剂盒， 包括用于配制PCR反应的引探混合物、 5RNA buffer、 热启动Taq酶和逆转录酶、 对照样本和RNase-free水， 其中

38、， 引物探针混合液包括如 下成分， 如表1， 0085 表1引物探针混合液 0086 0087 其中， SEQ ID NO： 11的5 端标记有FAM荧光报告基团， 3 标记有BHQ1荧光淬灭基 团； SEQ ID NO： 12的5 端标记有TexasRed荧光报告基团， 3 端标记有MGB； SEQ ID NO： 13的 5 端标记有VIC荧光报告基团， 3 端标记有BHQ1荧光淬灭基团； SEQ ID NO： 14的5 端标记有 TAMRA荧光报告基团， 3 端标记有BHQ1荧光淬灭基团； SEQ ID NO： 15的5 端标记有CY5荧光 报告基团， 3 端标记有MGB。 0088 样本

39、检测时， 甲型流感病毒通用上下游引物和探针， 分别与所扩增的目的片段结 合， 释放FAM荧光信号； 乙型流感病毒通用上下游引物和探针， 分别与所扩增的目的片段结 说明书 7/19 页 10 CN 112063756 A 10 合， 释放TexasRed荧光信号； 2019新型冠状病毒ORF1ab基因扩增引物和探针， 分别与所扩增 的目的片段结合， 释放VIC荧光信号； 2019新型冠状病毒N基因扩增引物和探针， 分别与所扩 增的目的片段结合， 释放TAMRA荧光信号； 内标基因扩增引物和探针， 分别与所扩增的目的 片段结合， 释放CY5荧光信号； 所述内控引物与探针是根据人管家基因保守片段设计

40、并合成 的， 用于样本和实验过程的监控； 0089 所述PCR反应液的5RNA buffer包括如下成分， 如表2， 0090 表2 5RNA buffer 0091 编号组分组分中的主要成分 15RNA buffer(NH4)2SO4、 KCl、 Tris-HCl、 MgCl2 0092 所述对照品包括如下成分， 如表3， 0093 表3对照样本 0094 编号组分组分中的主要成分 1阴性对照DEPC水 2阳性对照人工制备病毒样颗粒 0095 所述阳性对照的为人工制备的甲型流感病毒、 乙型流感病毒、 2019-nCoV OFR1ab 基因、 N基因及内标基因病毒样颗粒， 阴性对照样本为DEP

41、C水。 0096 本发明所述试剂盒适用样本为人鼻咽拭子、 咽拭子或痰液样本。 0097 本发明所述试剂盒用于判定检测有效性的标准为： 每次检测均设置阴性对照组和 阳性对照组， 当检测结果的阳性对照组为阳性， 且阴性对照组均为阴性时， 表明实验结果有 效。 0098 本发明还公开了一种甲型流感病毒、 乙型流感病毒和2019-nCoV病毒核酸定性检 测的方法， 具体步骤包括： 0099 1.处理待测样本并提取核酸样本， 可以是人鼻咽拭子、 咽拭子或痰液样本， 优选 地， 待测样本为人鼻咽拭子、 咽拭子。 0100 2.配制PCR反应体系， 将特异性引物和探针、 5RNA buffer、 热启动Ta

42、q酶和逆转 录酶， 加入提取的核酸5 L， 制备得到甲型流感病毒/乙型流感病毒/2019新型冠状病毒PCR 反应液； 反应液构成分别如表4， 0101 表4甲型流感病毒、 乙型流感病毒及2019新型冠状病毒PCR反应液 0102 0103 3.将PCR反应管放入仪器样品槽内， 并记录放置顺序。 0104 4.荧光通道选择： 0105 1)选择FAM通道检测甲型流感病毒； 说明书 8/19 页 11 CN 112063756 A 11 0106 2)选择VIC通道检测2019新型冠状病毒ORF1ab基因； 0107 3)选择TexasRed通道检测乙型流感病毒； 0108 4)选择TAMRA通道

43、检测2019新型冠状病毒N基因； 0109 5)选择CY5通道检测内标基因； 0110 6)选择参比荧光(Passive Reference)为None。 0111 5.设置循环条件如下表， 反应体系体积设置为25 L。 0112 0113 6.设置完成后， 保存文件， 运行程序。 0114 本申请采用的PCR检测原理如下： 应用实时荧光PCR技术， 设计特异性引物和探针 在一个PCR反应管内对人类鼻咽拭子、 口咽拭子或痰液样本中可能存在的甲型流感病毒、 乙 型流感病毒或2019新型冠状病毒进行检测。 设计的特异性引物和探针， 采用不同的荧光报 告基团分别对甲型流感病毒、 乙型流感病毒及201

44、9新型冠状病毒进行标记， 配以热启动DNA 聚合酶、 逆转录酶等成分组成核酸扩增试剂， 使用荧光PCR仪进行PCR扩增， 并检测荧光信 号， 将提取的核酸加入PCR反应管中， 仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线， 根据阈循环 值(Ct值)实现对未知样本的定性检测。 0115 与现有技术相比， 本发明的有益效果在于： 0116 本发明提供了一种检测人甲型流感病毒、 乙型流感病毒及新型冠状病毒核酸的方 法、 引物、 探针与试剂盒。 使用本发明提供的特异性引物与探针， 能够快速、 高灵敏且稳定地 检测疑似感染者是否感染甲型流感病毒、 乙型流感病毒或2019新型冠状病毒。 本发明能最 低能检测出的病毒

45、拷贝数为200copies/mL， 具有较的灵敏度。 操作过程简单、 能在一个反应 管中完成三种病原体的定性检测， 其中所检测的甲型流感病毒涵盖国内5种常见亚型包括 H1N1(2009)、 H1N1、 H3N2、 H5N1、 H7N9， 检测乙型流感病毒涵盖2种亚型包括Yamagata、 Victoria型， 2019新型冠状病毒采用双靶标进行检测， 检测结果更为可靠， 同时以人管家基 因为内标， 对核酸质量及样本采集等进行把控， 有效排除假阴性结果的产生。 本发明适用于 对疑似流感或新型冠状病毒肺炎者进行病毒核酸检测， 对患者进行确诊， 辅助指导临床医 生开展治疗工作， 值得推广应用。 01

46、17 另外， 本发明的方法同样适用于非诊断的目的， 例如， 可以对环境样本进行检测， 以公共卫生管理之需， 也可以用于呼吸道常见病毒新药的研发。 0118 下面结合具体实施例， 进一步详陈本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明详细条件的实验方法， 通常按照常规条 件如美国Sambrook.J等著 分子克隆实验室指南 (黄培堂等译， 北京： 科学出版社， 2002年) 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 除非另外说明， 否则百分比和份数按重量计 算。 以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。 0119 实施

47、例1： 检测方法及试剂盒 说明书 9/19 页 12 CN 112063756 A 12 0120 本实施例提供了可在一个反应管中同时检测甲型流感病毒、 乙型流感病毒、 新型 冠状病毒及内标核酸检测的方法、 引物、 探针及试剂盒， 使得检测体系灵敏度可以达到 200copies/mL。 具体实施步骤如下： 0121 步骤一、 待测样本RNA模板提取 0122 采集人鼻咽拭子样本置于拭子头浸入含采样液管中， 做好标记确保标签信息无误 后， 4保存。 12h内取200 L液态样本及试剂盒中的阴性和阳性对照进行核酸提取， 使用中 山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂盒(磁珠法)粤穗械备

48、20170583 号和粤穗械备20150302号； 也可使用其他的商业化产品； 提取的模板核酸可直接用于后续 实验或置于-80保存备用， 避免反复冻融。 0123 步骤二、 PCR体系的制备 0124 PCR体系配制前准备： 取出试剂盒中的引物探针混合液A、 5RNA buffer、 热启动 Taq酶和逆转录酶等， 室温融化， 涡旋震荡混匀后离心10秒， 配制PCR体系； PCR体系构成如表 6： 0125 表6.甲型流感病毒/乙型流感病毒/2019新型冠状病毒PCR体系 0126 0127 所述引物探针的核苷酸序列信息分别如下： 0128 检测甲型流感病毒/乙型流感病毒/2019新型冠状病毒

49、引物探针核苷酸序列信息： 说明书 10/19 页 13 CN 112063756 A 13 0129 0130 步骤三、 加样 0131 取步骤一所制备的样本核酸模板及对照样本各5 L， 加样至步骤二配制的PCR反应 体系的八连管中， 使PCR反应液的总体积为25 L； 盖紧八连管管盖， 充分混匀， 高速离心10 秒， 用于制备微反应； 所述试剂盒的对照样本如表7： 0132 表7.试剂盒的对照样本 0133 编号组分组分中的主要成分 1阴性对照DEPC水 2阳性对照人工制备的病毒样颗粒 0134 所述阳性对照样本为分别含有甲型流感病毒、 乙型流感病毒、 2019-nCoV ORF1ab 基因

50、、 N基因及内标GAPDH基因的人工制备的病毒样颗粒样本的混合物； 阴性对照样本为 DEPC水。 0135 步骤四、 PCR扩增 0136 将PCR反应管放入仪器样品槽内， 并记录放置顺序。 选择FAM通道检测甲型流感病 毒； 选择VIC通道检测2019新型冠状病毒ORF1ab基因； 选择TexasRed通道检测乙型流感病 说明书 11/19 页 14 CN 112063756 A 14 毒； 0137 选择TAMRA通道检测2019新型冠状病毒N基因； 选择CY5通道检测内标基因； 选择参 比荧光(Passive Reference)为None， 设置循环条件如下表， 反应体系体积设置为25