一株蜡样芽孢杆菌B-28及其应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010919073.6 (22)申请日 2020.09.04 (83)生物保藏信息 GDMCC NO： 61089 2020.07.13 (71)申请人 暨南大学 地址 510632 广东省广州市天河区黄埔大 道西601号 (72)发明人 李取生阮翔李万里范瀚允 侯思颖徐子杰 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 赵崇杨 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) B09C 1/10(2006.01) A01G 22/2

2、0(2018.01) A01G 7/06(2006.01) C12R 1/085(2006.01) (54)发明名称 一株蜡样芽孢杆菌B-28及其应用 (57)摘要 本发明公开了一株蜡样芽孢杆菌B28及其 应用。 本发明分离筛选得到了一株蜡样芽孢杆菌 B28， 该菌株已于2020年7月13日保藏于广东省 微生物菌种保藏中心， 其保藏编号为GDMCC NO： 61089。 该菌株具有较强的重金属Cd钝化能力、 以 及减少植物对重金属Cd吸收的能力， 同时能够修 复重金属Cd污染的土壤， 且该菌株能显著促进玉 米叶片叶绿素含量的增加和根部CAT和POD酶活 性的增强， 从而促进玉米各组织生物量的增

3、长； 因此， 该菌株在修复重金属Cd污染土壤、 促进植 物生长和阻控植物对重金属Cd吸收中具有非常 广阔的应用前景。 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 112094771 A 2020.12.18 CN 112094771 A 1.一株蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)B-28， 其特征在于， 该菌株已于2020年7月13 日保藏于广东省微生物菌种保藏中心， 其保藏编号为GDMCC NO： 61089。 2.权利要求1所述蜡样芽孢杆菌B-28在修复重金属Cd污染土壤中的应用。 3.权利要求1所述蜡样芽孢杆菌B-28在促进植物生长或制备植物生长促进剂中的应 用。 4.权利要

4、求1所述蜡样芽孢杆菌B-28在阻控植物对重金属Cd吸收中的应用。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 所述应用为蜡样芽孢杆菌B-28能够钝化重 金属Cd、 减少植物对重金属Cd的吸收。 6.一种阻控植物对重金属Cd吸收的方法， 其特征在于， 直接在植物根际接种权利要求1 所述蜡样芽孢杆菌B-28。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述植物为移苗46天后的植物。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述接种频次为每隔68天接种一次。 9.根据权利要求68任一所述的方法， 其特征在于， 所述植物为玉米。 10.一种植物生长促进剂， 其特征在于， 包括权利要求1所述

5、蜡样芽孢杆菌B-28或其菌 悬液。 权利要求书 1/1 页 2 CN 112094771 A 2 一株蜡样芽孢杆菌B-28及其应用 技术领域 0001 本发明属于土壤污染生物处理技术领域。 更具体地， 涉及一株蜡样芽孢杆菌B-28 及其应用。 背景技术 0002 镉是我国农田土壤重金属污染的主要元凶之一， 由于其具有高生物毒性和高迁移 率等特点， 已经对农产品安全造成了严重威胁。 如何降低土壤镉污染的风险， 减少农作物对 镉的吸收已成为一项紧迫的任务。 微生物钝化技术作为一个颇具前景的方向， 是指微生物 可以通过价态转化(如Cr(VI)转化为Cr(III)、 SeO42-转化为Se)、 生物吸

6、附(如微生物胞外聚 合物吸附)、 化学沉淀和挥发(如甲基汞转化为汞蒸气)等作用转换重金属的的化学形态或 减少该重金属对生物的毒性作用， 进而实现重金属污染的修复。 然而该技术应用条件苛刻， 推广起来成本太高， 难以实现其有效利用。 将微生物与植物联合起来应用于土壤重金属污 染中， 已成为一个热门的方向。 通过植物根系吸收吸附， 根系分泌物络合等方式减少和稳定 化土壤中的重金属。 微生物的接种不仅可以辅助钝化土壤中的重金属， 还能增强植物对重 金属的耐受性。 而植物释放的根系分泌物能为微生物的生长提供良好的营养物质。 植物-微 生物联合钝化技术被证实可以有效减少土壤中铅、 砷、 镉、 铬、 铜和

7、锌的迁移率， 减轻污染场 地的生态风险， 尤其是对于重金属浓度高及缺乏天然植被的地区。 0003 一般认为， 重金属有效性的降低主要是在根际促生菌的作用下， 土壤中的可交换 态重金属向碳酸盐结合态转化。 有研究发现， 枯草芽孢杆菌的细胞壁及胞外聚合物中的羧 基、 羟基、 羰基， 酰胺基和磷酸基团可与菌株表面的Pb络合， 同时还形成Pb5(PO4)3OH、 Pb5 (PO4)3Cl和Pb10(PO4)6(OH)2沉淀物， 稳定土壤中的铅(Bai J ,Yang X ,Du R ,et al， Biosorption mechanisms involved in immobilization of

8、 soil Pb by Bacillus subtilis DBM in a multi-metal-contaminated soilJ， Journal of Environmental Sciences， 2014， 26(10):2056-2064)。 此外， 微生物通过产生抗生素及其他抑制病原体的物 质(如铁载体和螯合剂)、 植物激素(如吲哚乙酸和细胞分裂素)和特定酶(产ACC脱氨酶)活 性等方式， 增强植物的抗病性和抗逆性从而促进植物生长。 0004 目前， 公开日为2016年9月7日、 公开号为CN105925507A的中国发明专利公开了具 有重金属钝化和促进植物生长功能的蜡样芽

9、孢杆菌B19； 但是， 在探究蜡样芽孢杆菌促进植 物生长以及阻控植物吸收Cd时， 该现有技术是直接通过土培进行， 而土壤中影响因素众多， 菌落复杂， 除蜡样芽孢杆菌外， 还存在其他菌种可能起作用， 并不能严谨地控制实验条件。 因此， 提供一种不受土壤中其他因素影响、 结果准确可靠、 能够有效阻控植物对重金属Cd吸 收同时促进植物生长的方法具有重要意义。 发明内容 0005 本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足， 提供一株蜡样芽孢 杆菌B-28及其应用。 本发明利用砂培实验， 用洗净灭菌的石英砂培养植物， 施加仅含有蜡样 说明书 1/6 页 3 CN 112094771 A 3

10、芽孢杆菌B-28的菌剂， 影响因素单一， 完美地控制了实验变量， 结果更加准确可靠。 0006 本发明的目的是提供一株蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)B-28。 0007 本发明另一目的是提供所述蜡样芽孢杆菌B-28在修复重金属Cd污染土壤中的应 用。 0008 本发明另一目的是提供所述蜡样芽孢杆菌B-28在促进植物生长或制备植物生长 促进剂中的应用。 0009 本发明另一目的是提供所述蜡样芽孢杆菌B-28在阻控植物对重金属Cd吸收中的 应用。 0010 本发明另一目的是提供一种阻控植物对重金属Cd吸收的方法。 0011 本发明再一目的是提供一种植物生长促进剂。 0012 本发明

11、上述目的通过以下技术方案实现： 0013 本发明从玉米根际土壤中分离得到了一株蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)B- 28， 该菌株已于2020年7月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心， 其保藏编号为GDMCC NO： 61089， 保藏地址： 广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。 0014 本发明研究发现蜡样芽孢杆菌B-28具有较强的重金属Cd钝化能力、 以及减少植物 对重金属Cd吸收的能力， 同时能够修复重金属Cd污染的土壤， 且该菌株能够促进植物的生 长； 因此， 以下应用均应在本发明的保护范围之内： 0015 所述蜡样芽孢杆菌B-28在修复重金属Cd污染土壤中的应用。

12、 0016 所述蜡样芽孢杆菌B-28在促进植物生长或制备植物生长促进剂中的应用。 0017 所述蜡样芽孢杆菌B-28在阻控植物对重金属Cd吸收中的应用。 0018 优选地， 所述应用为蜡样芽孢杆菌B-28能够钝化重金属Cd、 减少植物对重金属Cd 的吸收。 0019 本发明还提供了一种阻控植物对重金属Cd吸收的方法， 直接在植物根际接种所述 蜡样芽孢杆菌B-28。 0020 优选地， 所述植物为移苗46天后的植物。 0021 更优选地， 所述植物为移苗5天后的植物。 0022 优选地， 所述接种频次为每隔68天接种一次。 0023 更优选地， 所述接种频次为每隔7天接种一次。 0024 优选地

13、， 所述植物为玉米。 0025 另外， 本发明还提供了一种植物生长促进剂， 包括所述蜡样芽孢杆菌B-28或其菌 悬液。 0026 本发明具有以下有益效果： 0027 本发明提供了一株蜡样芽孢杆菌B-28及其应用。 本发明从玉米根际土壤中筛选出 了一株高效促进玉米生长和降低Cd吸收的蜡样芽孢杆菌B-28， 并通过砂培实验、 土培实验 以及摇瓶实验， 发现该菌株能够通过官能团络合或吸附Cd从而降低水溶态Cd浓度， 显著地 降低Cd生物有效性， 使得玉米对Cd吸收减少， 玉米各组织中Cd含量均明显下降； 同时， 该菌 株能显著促进玉米叶片叶绿素含量的增加和根部CAT和POD酶活性的增强， 从而促进玉

14、米各 组织生物量的增长； 因此， 该菌株在修复重金属Cd污染土壤、 促进植物生长和阻控植物对重 金属Cd吸收中具有非常广阔的应用前景。 说明书 2/6 页 4 CN 112094771 A 4 附图说明 0028 图1是蜡样芽孢杆菌B-28对水溶态Cd的吸附效果图； 其中， (a)图是培养基pH值和 蜡样芽孢杆菌B-28菌株生长情况结果； (b)图是培养基上清液、 蜡样芽孢杆菌B-28菌株细胞 壁吸附和胞内积累Cd浓度结果。 0029 图2是砂培实验不同条件下玉米组织Cd含量结果图； 其中， (a)图是玉米根中Cd含 量； (b)图是玉米茎中Cd含量； (c)图是玉米叶中Cd含量； (d)图是

15、玉米粒中Cd含量； (e)图是 玉米穗中Cd含量； (f)图是根际砂水溶态Cd含量； 0030 注： 在相同砂培Cd浓度处理下， 小写字母不同表示接种蜡样芽孢杆菌B-28菌株与 不接种对照相比差异显著(p0.05)。 0031 图3是接种蜡样芽孢杆菌B-28对玉米生长的直接影响结果图； 其中， (a)图是玉米 根鲜重； (b)图是玉米茎鲜重； (c)图是玉米叶鲜重； (d)图是玉米粒鲜重； (e)图是玉米穗鲜 重； (f)图是玉米株高； 0032 注： 在相同Cd浓度处理处理下， 小写字母不同表示接种蜡样芽孢杆菌B-28处理和 不接菌对照差异显著(p0.05)； 在接种蜡样芽孢杆菌B-28菌株

16、处理或不接菌处理下， 大写 字母不同表示不同砂培Cd浓度处理差异显著(p0.05)。 具体实施方式 0033 以下结合具体实施例来进一步说明本发明， 但实施例并不对本发明做任何形式的 限定。 除非特别说明， 本发明采用的试剂、 方法和设备为本技术领域常规试剂、 方法和设备。 0034 除非特别说明， 以下实施例所用试剂和材料均为市购。 0035 本发明将分离自玉米根际土壤中的耐镉菌B-28经16s rDNA序列分析及API试剂条 反应， 鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)， 命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus) B-28， 并于2020年7月13日保藏于广东省

17、微生物菌种保藏中心， 其保藏编号为GDMCC NO： 61089， 保藏地址： 广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。 0036 实施例1蜡样芽孢杆菌B-28对水溶态Cd的吸附效果 0037 1、 实验方法 0038 将蜡样芽孢杆菌B-28接种于LB培养基中培养过夜， 6000rpm离心10min， 弃去上清 液， 然后使用无菌水洗涤菌体2次， 最后重悬于无菌水中获得备用菌液， 随后接种0.5mL菌液 至100mL含有1mg/L Cd(以Cd(NO3)2形式添加)的LB培养基中， 并以接种至无Cd的LB培养基 为对照， 各处理三个平行。 置于摇床中180rpm 30培养。 菌株培养的第1、

18、3、 5、 7天取样一 次， 测定菌液的OD600值和pH值， 随后将菌液6000rpm离心10min， 获得菌体沉淀。 将收获的菌 体用无菌水洗涤两次， 然后加入20mL 10mM的EDTA溶液搅拌10分钟， 以洗涤去除细胞表面吸 附的Cd， 收集洗涤液， 用于测定细胞外吸附的Cd含量。 菌体沉淀加入8mL硝酸消解， 用于测定 菌株胞内Cd含量。 0039 2、 实验结果 0040 蜡样芽孢杆菌B-28对水溶态Cd的吸附效果图如图1所示， 可以看出， LB培养基的Cd 初始浓度为1mg/L时， 接种蜡样芽孢杆菌B-28第1天急剧下降到6.8 g/L， 第3天降低至最低 值为5.0 g/L，

19、吸附效率为99.5， 然后在第5天和第7天分别上升到29.8 g/L和34.1 g/L； 可以看出， 蜡样芽孢杆菌B-28在第3天时吸附效率最高， 此后上清液Cd浓度虽逐渐升高， 但 说明书 3/6 页 5 CN 112094771 A 5 Cd吸附效率依旧在95以上。 0041 蜡样芽孢杆菌B-28胞外Cd浓度从培养第1天42.1 g/L降低至第3天的38.4 g/L， 此 后逐渐升高至第7天的67.7 g/L； 而蜡样芽孢杆菌B-28胞内Cd浓度从第1天的0.80mg/L升高 至第5天的0.92mg/L， 此后降低至第7天的0.85mg/L； 可以看出， 蜡样芽孢杆菌B-28胞内Cd浓 度

20、显著高于胞外， 这表明菌株对Cd的吸附主要以胞内为主(95)， 细胞壁吸附只占Cd吸收 的5左右。 0042 实施例2接种蜡样芽孢杆菌B-28对玉米吸收Cd的影响 0043 1、 实验方法 0044 本研究通过砂培实验， 设置5个不同Cd浓度， 探究蜡样芽孢杆菌B-28对玉米生长及 镉吸收影响。 实验共10个处理， 分别为： 0.03J(盆栽中添加Cd浓度为0.03mg/kg石英砂， 后 同； 接菌)、 0.06J(Cd浓度0.06mg/kg， 接菌)、 0.09J(Cd浓度0.09mmg/kg， 接菌)、 0.12J(Cd浓 度0.12mg/kg， 接菌)、 0.15J(Cd浓度0.15mg

21、/kg， 接菌)及5个各Cd浓度的不接菌对照： 0.03CK、 0.06CK、 0.09CK、 0.12CK和0.15CK。 各处理共4个平行， 共计40盆， 每盆含有4kg石英 砂。 0045 玉米种子使用前采用10H2O2消毒0.5h， 然后用无菌水清洗种子2次， 并浸泡24h以 促进种子发芽。 浸泡后的玉米种子播种于铺满湿润石英砂的育苗板中， 盖上吸水纸， 保持黑 暗环境以保证种子萌发。 待玉米种子长出两片绿叶后， 选取长势相同的玉米苗移植至盆中， 移苗5d后使每盆剩余3株长势均匀的幼苗。 育苗及砂培盆栽实验均于植物人工气候培养箱 中进行， 湿度设置为65， 日间时长14h， 温度为30

22、， 光照强度为20000lux； 夜间时长10h， 温度为25， 无光照。 每天浇50mL 1/3霍格兰营养液， 以满足玉米生长对不同元素的需求。 向盆中添加0.15mg Cd(以Cd(NO3)2溶液形式添加， 砂培Cd浓度为0.15mg/kg干石英砂)。 0046 盆栽实验于温室进行， 白天平均温度为32， 湿度为45， 夜间平均温度为22， 湿度为70。 在移植7天后开始接菌处理， 实验期间共向玉米根际接种8次蜡样芽孢杆菌B- 28菌液。 0047 2、 实验结果 0048 砂培实验不同条件下玉米组织Cd含量结果图如图2所示， 可以看出， 砂培实验Cd浓 度为0.09mg/kg、 0.12

23、mg/kg和0.15mg/kg时， 接种蜡样芽孢杆菌B-28可显著降低玉米不同组 织Cd含量， 其中， 根Cd浓度降低30.539.9、 茎Cd浓度降低17.027.5、 叶浓度降 低21.126.5、 玉米粒(可食用部分)Cd浓度降低20.933.2、 玉米穗轴Cd浓度降 低25.742.5； 但砂培实验Cd浓度为0.03mg/kg和0.06mg/kg时， 不接种处理与接种蜡 样芽孢杆菌B-28处理下玉米各组织的Cd含量没有显著变化。 0049 实施例3接种蜡样芽孢杆菌B-28对玉米生长的直接影响 0050 1、 实验方法 0051 待玉米生长100天后进行收获。 在收获时先测量玉米植株的高

24、度， 抖动玉米根洗， 从而将根际砂分离， 用去离子水洗净并于0.5mM CaCl2中浸泡0.5h以去除玉米根表附着的 Cd， 用吸水纸擦拭表面以去除根表附着的水分。 玉米组织分为根、 茎、 叶、 玉米粒和玉米穗轴 分别称取鲜重， 并各保留部分新鲜样品立即用液氮猝灭保存于-80冰箱(海尔DW- 86L626)， 用于植物酶活性及叶绿素测定， 将剩余的组织样品装入信封并置于恒温烘箱中 105杀青0.5h， 随后80烘干至恒重。 说明书 4/6 页 6 CN 112094771 A 6 0052 2、 实验结果 0053 接种蜡样芽孢杆菌B-28对玉米生长的直接影响结果图如图3所示， 可以看出， 在

25、不 同Cd浓度处理下蜡样芽孢杆菌B-28均能显著促进玉米生物量及株高的增加， 其中， 根鲜重 的增长25.664.3， 茎鲜重增长21.232.9， 叶鲜重增长14.541.0， 玉米粒 (可食用部分)增长22.852.6， 玉米穗轴增长11.150.5； 在砂培Cd浓度为 0.09mg/kg时， 各组织鲜重增长率均最大分别为根64.3、 茎32.9、 叶41.0、 玉米粒 52.6和玉米穗轴50.5； 与不接种蜡样芽孢杆菌B-28相比， 接菌处理下玉米株高也显著 增长7.011.8。 0054 以上结果表明： 在不同Cd浓度下， 接种蜡样芽孢杆菌B-28均能显著促进玉米的生 长(p0.05)

26、。 0055 实施例4接种蜡样芽孢杆菌B-28对玉米生长的间接影响 0056 1、 实验方法 0057 (1)叶绿素含量测定： 对液氮淬灭后的玉米样品， 选取干净完整的新鲜玉米叶片组 织， 用剪刀剪碎， 然后准确称量0.1g样品放入研钵中， 同时添加5mL80丙酮， 充分研磨至没 有叶片组织后转移至离心管中， 向研钵中加入1mL 80丙酮润洗研钵内壁3次， 最后将研磨 液定容至8mL， 包裹锡箔纸后转移至黑暗处常温下浸提12h。 当观察到研磨液沉淀发白后 8000rpm离心5min， 测定上清液中的叶绿素含量。 叶绿素的提取和测定实验全程均在黑暗避 光条件下进行。 0058 (2)POD酶和C

27、AT酶活性测定： 通过愈创木酚法测定POD酶活性， 其原理为： 愈创木酚 能被植物组织中的过氧化物氧化， 生成在470nm有特定吸光度的茶褐色物质， 通过测量生成 物的量在单位时间内的变化即可得出植物组织的POD酶活性。 过氧化氢酶(CAT)活性通过 H2O2分解速率测定， 当波长为240nm时， H2O2对该波长的可见光具有强烈吸收， 因此通过吸光 度的降低速率即可计算CAT酶活性。 0059 2、 实验结果 0060 砂培实验各处理玉米叶片叶绿素含量和根抗氧化酶活性结果如表1所示， 可以看 出， 在不同Cd浓度处理下， 玉米叶绿素A(Chl a)、 叶绿素B(Chl b)和总叶绿素含量(T

28、otal Chl)在接菌处理下显著高于不接菌处理， 叶绿素A/B和总叶绿素含量分别增加17.5 45.5、 14.049.9和20.544.4； 除Cd浓度为0.03mg/kg外， 玉米根部的CAT酶活 性在接菌处理下显著高于不接菌处理， 增长率为9.475 .0， 其中砂培Cd浓度为 0.15mg/kg时， 增长幅度最大为75.0。 玉米根部POD酶活性在接菌处理后也高于不接菌处 理， 增长范围为13.432.0； 其中Cd浓度为0.09mg/kg和0.15mg/kg时根部POD酶活性显 著增加27.9和32.0(p0.05)， 高于其他Cd浓度处理。 0061 表1砂培实验各处理玉米叶片叶

29、绿素含量和根抗氧化酶活性结果 0062 说明书 5/6 页 7 CN 112094771 A 7 0063 0064 注： J表示接种蜡样芽胞杆菌B-28处理， CK表示不接菌对照处理； 数据表示平均值 SD， n4。 采用Duncan多重比较， 不同小写字母表示相同Cd浓度处理下， 接菌和不接菌具 有显著差异(p0.05)， 不同大写字母表示接菌或不接菌处理下， 不同Cd浓度处理具有显著 差异(p0.05)。 0065 以上结果表明： 在不同Cd浓度的砂培实验中接种蜡样芽孢杆菌B-28， 玉米叶片的 叶绿素a/b和总叶绿素含量均比不接菌对照有显著增加； 说明蜡样芽孢杆菌B-28能缓解玉 米因

30、Cd胁迫而导致的叶绿素受损， 对玉米叶片的光合作用和植物生长产生了积极作用， 从 而促进了玉米生物量的提高。 0066 与不接菌相比， 在不同Cd浓度下接种蜡样芽孢杆菌B-28均能显著提高玉米根部抗 氧化酶(CAT和POD酶)的活性； 表明向玉米根部接种蜡样芽孢杆菌B-28后， 活性氧清除系统 的活性得到增强， 植物抗氧化能力显著提高， 这能有效缓解土壤Cd对玉米根部的胁迫， 从而 维持植物根细胞的正常代谢， 间接提高玉米的生物量， 促进玉米的生长。 0067 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 说明书 6/6 页 8 CN 112094771 A 8 图1 说明书附图 1/3 页 9 CN 112094771 A 9 图2 说明书附图 2/3 页 10 CN 112094771 A 10 图3 说明书附图 3/3 页 11 CN 112094771 A 11